试剂准备
  1. 4-硫尿核苷储存液 (1 M): 260.27 mg 4-硫尿核苷, 1 ml DMSO
  2. 多西环素储存液(10 mg/ml): 10 mg 多西环素, 1 ml DMSO
  3. 5× NP40 裂解液: 制备无DTT和蛋白酶抑制剂的5×的储存液, 50 mM HEPES (pH 7.5), 150 mM KCl, 2 mM EDTA, 1 mM NaF, 0.5% (v/v) NP40
  4. 柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液: 4.7 g/L 柠檬酸, 9.2 g/L Na2HPO4, pH 5.0
  5. IP洗涤缓冲液: 50 mM HEPES-KOH (pH 7.5), 300 mM KCl, 0.05% (v/v) NP40
  6. 高盐洗涤缓冲液: 50 mM HEPES-KOH (pH 7.5), 500 mM KCl, 0.05% (v/v) NP40
  7. 脱磷酸缓冲液: 50 mM Tris-HCl (pH 7.9), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2 and 1 mM DTT
  8. 磷酸酶洗涤缓冲液: 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 20 mM/review/reagent/EGTA.html EGTA, 0.5% (v/v) NP40
  9. 多核苷酸激酶 (PNK)缓冲液无DTT: 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2
  10. PNK 缓冲液: 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT
  11. SDS-PAGE loading buffer: 10% glycerol (v/v), 50 mM Tris-HCl (pH 6.8), 2 mM EDTA, 2% SDS (w/v), 100 mM DTT, 0.1% bromophenol blue
  12. 2×蛋白酶K缓冲液: 100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 12.5 mM EDTA, 2% (w/v) SDS
  13. 5× NP40 裂解液、IP洗涤缓冲液、高盐洗涤缓冲液等在实验前直接加入0.5 mM DTT和无EDTA的蛋白酶抑制剂cocktail (Roche) 后使用。
步骤
  1. 细胞培养和体外交联
    1. 在培养皿中培养增殖细胞（15cm 培养板），培养至饱和度为80%。
    2. 直接加入4-硫尿核苷至终浓度100μM至细胞培养液中。
    3. 在交联后14小时 ，每块板中用10ml预冷的1×PBS洗一次细胞，然后完全移除PBS。
    4. 将培养板放在有冰的托盘上，并且在0.15 J/cm2、356nm的紫外灯下进行照射。5.在培养板中加1ml1×PBS，然后用橡胶棒将细胞刮下
    5. 将细胞转移到50ml离心管中，4℃下500g离心5min，去除上清液。
  2. RNA酶T1消化
    1. 在沉淀的细胞中加入3倍体积的1×NP-40裂解缓冲液，并且在冰上静置10min。
    2. 将细胞裂解液在13,000g、4℃下离心15min，弃沉淀。
    3. 用0.2um膜注射器式滤器进一步清洗细胞裂解液。
    4. 加RNA酶T1\至终浓度1U/μl并且在22℃水浴锅中孵15min。然后在冰上使其反应5min。
  3. 预备磁珠
    1. 每毫升细胞裂解液加入10μ蛋白 G 磁珠颗粒到1.5ml小试管中。用1ml柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液清洗珠子两遍。
    2. 按照原来珠子混悬液的体积再用两次同体积的柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液重悬。
    3. 每毫升悬液加0.25 μg特异性抗体，然后在室温进行40min旋转孵育。
    4. 用1ml柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液洗珠子两次。
  4. 免疫共沉淀
    1. 加入20μl新配置的抗体-磁珠处理细胞裂解液(用RNA酶T1处理)，然后在4°C下15ml离心管中旋转混匀1h。
    2. 用磁力分选器收集磁珠，并转入到1.5ml小离心管中。
    3. 用IP缓冲液清洗珠子3次
  5. 第二次RNA酶T1消化以及去磷酸化
    1. 加入RNA酶T1至终浓度100 U/μl，然后在22°C水浴锅中孵育珠子混悬液15min，接着在冰上静置5min。
    2. 用高盐缓冲溶液洗珠子三次。
    3. 用等体积的去磷酸缓冲液重悬珠子。
    4. 加入小牛小肠碱性磷酸酯酶至终浓度0.5 U/μl，然后在37°C下静置混悬液10min。
    5. 用1ml磷酸盐缓冲液洗珠子两次
    6. 在不含有DTT的多核苷酸激酶中洗珠子两次。
    7. 用原来体积的珠子PNK缓冲液重悬珠子。
  6. 放射性标记RNA片段并交联免疫共沉淀蛋白
    1. 加γ-32P-ATP至终浓度0.5 μCi/μl和T4多核苷酸激酶至终浓度1 U/μl到上面的珠子混悬液。37°C下静置混悬液30min。
    2. 加入无放射性标记的ATP到终浓度100μM，然后再在37°C下静置混悬液5min。
    3. 用700μl不含有DTT的多核苷酸激酶的缓冲液洗珠子5次。
    4. 在60μl十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）加样缓冲液中重悬珠子。
  7. SDS-PAGE凝胶电泳并洗脱RNA-蛋白复合物和蛋白酶K消化
    1. 将放射线标记的混悬液在95℃加热器上加热5min（使其变性并释放同交联的RNA的免疫共沉淀的RBP），然后涡旋。
    2. 在磁力分选器上将磁珠移除，并将上清液转移到新的1.5ml的小试管中。
    3. 每个孔道中加40μl Novex Bis-Tris 4-12%预处理过的上清液，然后跑聚丙烯酰胺凝胶（200V、55min）。
    4. 将胶从胶槽中拿出，将胶放在一个平板上。为了使胶上的片段在磷光指示带上被标出，我们植入三个小的放射性的胶段到胶三个角中。放射性胶段能从胶中收集，被最先用来纯化放射性标记的合成寡聚核苷酸。
    5. 将胶包起来放置在空白的磷光板上扫描1h使其完全显现。
    6. 将胶摆在磷光板上面，使用植入的胶段来用作定位。将预计的RBP大小片段的胶带切下，然后转移到透析柱中，加入800μl 1×SDS电泳缓冲液。
    7. 在1×SDS电泳缓冲液中、100V下电洗脱交联的RNA-RBP混合物2h使其从胶中分离出来，切断胶条然后在D型管中电洗脱。
    8. 加等体积的2×的蛋白酶K缓冲液到电洗脱物中，然后在加蛋白酶K至终浓度1.2mg/ml。55℃静置30min。
    9. 用酸性的苯酚/氯仿/碘乙酰胺（25:24:1，pH=4.0）来还原RNA，紧接着用氯仿萃取。加1μl糖原（10mg/ml）和3倍体积的乙醇来沉淀RNA。用10.5μl水来溶解沉淀。
  8. cDNA库和深入测序（Deep-sequencing和生物信息学分析
      通过标准制备cDNA库的说明书来处理之前收集到的RNA，并且使用Solexa测序技术。一次的Solexa测序通常能承载6-10百万个片段同时进行，足够覆盖整个转录范围的RNA结合蛋白的结合位点。

      为了获得有用的RNA-RBP结合位点的信息，好的生物信息学分析是很需要的。将序列与基因组和EST数据库进行比对。通常，比对的序列不能超过一个碱基的错配，插入、切除直到序列簇的建立为以后的分析都是很有帮助的。

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