处于三维环境中的体内细胞具有特征性的生理和生物力学信号，影响细胞迁移、粘附、增殖和基因表达等功能（图1） [2-5] 。 组织工程中特定细胞过程（如分化和形态发生）已被证明在三维环境中（3-D）比二维环境（2-D）中更容易发生 [6, 7] 。 培养在3-D聚乙二醇（PEG）水凝胶中的间充质干细胞（MSCs）与生长在组织培养塑料平皿表面相比会显著上调平滑肌特异蛋白如αSMA和平滑肌肌球蛋白的表达 [8] 。人类胚胎干细胞（hESC）在3-D中比2-D中分化成心肌细胞的效率更高，且在3-D中显著上调如MLC-2A/2V，cTnT， ANP，α-MHC and KV4。3等心脏功能特定标记物 [9] 。具有家族性阿尔茨海默氏症突变的人神经干细胞，只有在三维培养中才能重现beta淀粉样斑块和神经纤维缠结 [10] 。

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图 1. 三维细胞培养的示意图。

最近，含磁性氧化铁（MIO）的水凝胶已被用于处理培养细胞，细胞在含磁铁的培养基中悬浮。以这种方式，培养的细胞完全离开基于重力的基底 [1] 。磁悬浮技术已经用于开发乳房肿瘤的体外模型 [11] 。由于在体内的细胞仍然受重力影响，这种人工悬浮液对细胞代谢和行为的影响仍有待研究。在2015年，DNA程式化的细胞组装已被用于将细胞组装成想要的3三维组织 [12] 。

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图 2. 应用磁悬浮的三维细胞培养示意图。来源于参考文献 [1] 。

这篇综述将讨论各种三维细胞培养体系。

我们对三维细胞培养支架和模型的重要性的认识正不断加深。三维细胞培养能更准确地模拟正常的细胞形态，增殖，分化和迁移。

一个研究转变正在进行， 那就是3-D的细胞培养体系正取代2-D培养体系。在体内动物模型检测之前或作为它的一种替代方式，体外实验正逐渐从2-D转变为3-D [9, 13] 。

• 三维培养体系可以利用允许对模拟的细胞微环境进行轻易操作的方法人工合成。
• 三维培养体系可以用细胞模拟不同的疾病状态来研究疾病模型 [14] 。这也减少了对动物模型的需求。
• 研究药物剂量的影响，体外培养的细胞在三维中比在二维中更接近现实情况，因为细胞在2-D中与3-D中对药物的反应有差异 [15] 。在3-D中，多层细胞而非（2-D中）仅仅单层细胞以及将细胞紧密结合在一起的紧密连接通过阻断或减缓影响药物的扩散，形成对药物天然屏障 [13, 14, 16, 17] 。
• 支架可以被合成以支持三维细胞生长，同时用于生长因子、药物或基因的传送 [18-22] 。
• 三维细胞培养在组织工程和再生医学领域有着直接的应用。

包含着生物信号分子的支架材料可以通过引导移植的细胞粘附、增殖以及分化或者在组织再生部位自发的细胞浸润来介导组织形成。3-D支架通常是生物兼容性的，以与组织生长相适应的速度降解和被吸收，因此决定了同化再生细胞结构的形状和功能 [23] 。 不管是合成的还是天然的3-D支架都有优于2-D表面支架的优势。虽然天然材料提供了重要的信号分子来介导生物兼容性，但他们往往缺乏合成材料的机械支持力。而复合材料则可以用来结合他们不同的优点。

目前已有很多种不同的支架使用各种各样的材料被研发出来，尤其是下面几种：水凝胶，商品化定制的支架，纤维支架，多孔支架，微球以及天然组织支架。

这些支架可利用各种制造技术来制成。然而，并没有通用的支架，使用哪种支架取决于想要实现的功能和所需的特性。

决定三维支架设计标准的一系列特性如下：生物材料；生物相容性；生物可降解性；孔隙率、孔径；几何结构；细胞共培养；形状和大小；连通性；导向性；力学性能（张力强度、弹性系数等） [24] ；加入生理信号以及储存可溶性信号的能力；包含有不同的ECM（细胞外基质）。

海绵或泡沫多孔支架在组织工程应用中已被广泛使用。这些材料通常具有较高的孔隙率和均质的连通结构。合成的生物可降解的聚合物如聚乳酸、PGA，PLGA，PCL，PDLLA，以及基于PEO，PBT的PEE作为多孔支架材料被使用。

多孔支架材料的制备方法：

• 盐析法（致孔剂沥滤法）：晶体盐如氯化钠（普通食盐）放入模具。然后，将聚合物倾倒在盐上，聚合物穿透盐晶体之间的空隙。待聚合物硬化后，将盐透析于溶剂中。
  

  也可以使用糖和蜡。它的优点包括简单，多功能性，能控制孔洞的几何形状和大小。然而，它只能产生厚至3毫米的支架并且很难获得精确的连通性。
  

  新一代盐致孔剂和改良的粒子浸出法正在开发中，使盐晶体尺寸精确控制在最大为几微米的一个较窄的粒径范围 [25] ，并更好地控制随之而来的孔径和孔隙率 [26] 。

• 溶剂浇铸法：将聚合物溶解于有机溶剂中，然后将其与陶瓷颗粒混合，然后将溶液浇铸于一个预先设定的三维模具中。
  

  这种技术的主要优点是易于制造，简单，以及能够将药物（如抗生素，抗氧化剂）包含在支架内。主要的缺点是，只有简单的形状（如平板和管）可以制造，连通性较低。此外，它是一个耗时的技术，有毒溶剂会蛋白变形并影响其他溶剂。

• 气体发泡法：首先将聚合物迅速搅拌形成泡沫，然后硬化，形成一个固态的海绵状物体，泡沫的气泡最终形成支架的孔隙。
  这种技术的主要优点是：它不需要任何溶剂或固体致孔剂。缺点是：在压缩成型过程中会使用过多的热量，且孔与孔之间往往不形成一个相互连通的结构。结合颗粒浸出技术能使空气发泡法制造的支架获得开放的孔隙结构。
• 熔融成型法：聚合物分子和致孔剂在模具中混合，加热到高于无定形聚合物的玻璃化转变温度，或半结晶聚合物的熔融温度，使聚合物重组和结合。复合材料随后冷却，从模具中取出，浸泡在液体中滤出致孔剂。该技术有利于包含生物活性分子，残留的有机溶剂是不能避免的，然而该技术也有受限因素：较高的塑形温度会使生物分子变性。
• 微球体烧结：在这个过程中，首先制备陶瓷/聚合物复合微球，然后烧结成三维多孔支架 [27] 。

通常会联合运用多种方法来制造支架。

纤维支架的主要特征在于它们的纤维结构，为细胞附着提供了较大的表面积。这些支架具有较大的纤维间距离，有利于营养和气体交换以及细胞浸润。天然和合成的聚合物也被探索用来制作纤维支架。其中包括胶原、透明质酸（HA）、蚕丝、壳聚糖、PLA、PLGA、PCL、PU、和PEVA。

方法

• 纤维网：这些支架是由独立纤维平织或编织成孔径可变的三维模式。然而，他们可能缺乏体内应用所需的结构和机械稳定性
• 纤维粘结：这项技术的开发是为了克服纤维网的局限性，具体来说：在纤维交叉点处利用特定的溶剂，将温度加热到聚合物的熔点以上使纤维粘合。主要优点是简单、使用生物相容性材料、比毛毡和流苏样排列有结构上的优势，而缺点是不能控制孔径和孔隙率，缺乏合适的溶剂，两种聚合物组分在熔融状态不能相混融，以及所需聚合物的相对熔融温度。
• 静电纺丝技术：这种技术通过静电喷雾多聚物材料，产生直径从亚微米到纳米级的连续纤维涂层。静电纺丝支架在神经组织工程有广泛的应用 [33, 34] 。它们主要为神经突生长和轴突延伸提供结构上的引导。此外，纤维状神经导管可以被植入受伤部位。
  静电纺丝技术具有以下优点：能够产生具有特异导向性的超精细纤维，高纵横比，高表面积和可控制的孔径，但主要受限于细胞接种。
• 相态分离 [35] ：通常用一种低熔点（容易升华）的溶剂来溶解聚合物。加入水诱导相态分离，形成聚合物的富集相和贫相。通过将温度冷却至溶剂的熔点以下得到支架，再利用真空干燥法使溶剂升华
• 自组装 [36] ：即专门设计的肽纤维自组装形成稳定和高度有序的纳米级支架。

用组织状水凝胶作为支架材料引起很多的兴趣，因为它们体现了像组织一样柔度，同时具有粘弹性，间隙流动性和类似于天然组织的可扩散传送特性。用于形成水凝胶的天然高分子聚合物包括纤维蛋白原 [22, 45] ，透明质酸（HA） [17, 46] ，藻胶、胶原、明胶和壳聚糖。用于形成水凝胶的合成聚合物包括聚乙二醇（PEG）及其衍生物，聚乳酸（PLA）和聚乙烯醇（PVA）。

方法

• 溶剂浇铸和颗粒沥虑：稍微改良过的这些方法已被用于制备水凝胶 [47] 。见上文。
• 气体发泡：使用发泡方法制备水凝胶已经被很好地特征性描述和研究过 [48] 。见上文。
• 冷冻干燥：这种技术基于升华原理，首先将聚合物按所需的浓度溶于溶剂中，冷冻，随后低压冻干除去溶剂。它不需要高温或分离过滤步骤，支架具有较高的孔隙率和连通性，孔径的大小可以通过调节冷冻速率和pH值来控制，它的限制因素是：处理时间长，产生孔径较小。
• 共聚合/交联方法：其他方法包括聚合物凝胶，自由基聚合，原位聚合和光聚合。
• 微流控芯片：使用微流控芯片制备水凝胶是一个即将出现的技术。这种技术的主要优点是，可制备具有均一孔径，孔隙率和复杂样式的水凝胶 [49] 。可重复的水凝胶三维细胞培养体系可以用微流控芯片技术实现 [50] 。

这也被称为快速原型制造或固相自由形式制造。自定义支架可以使用计算机辅助设计（CAD）来制作，即用计算机系统协助创建，修改，分析或优化一个设计。计算机辅助设计的输出形式通常是为打印或机械加工操作设计的电子文件。计算机辅助设计的输出包括形状、材料、工序和尺寸的具体信息。已经有很多不同方法利用CAD设计的数字模型来进行进一步加工。这基本上是使用附加工序来实现，即通过铺设连续的材料层制作一个物件。

方法

• 固体光刻技术 [56] ：固体光刻（或光固化）技术由Chuck Hall 在1987年获得专利。可交联的液体树脂使用紫外线或可见光诱发光聚合，使用激光栅格或动态遮光的方法一次（制作）一个二维截面层。层层光固化的聚（乙二醇）二甲基丙烯酸酯 （能被光交联）已被证明能够帮助配体，细胞外基质（ECM）成分、生长因子和控释颗粒的精确排布 [57] 。该技术能够制作预先设计的内部结构和孔隙。
  这种技术的其他优点是较短的建立时间，使用动态遮光的方法，设备成本低，无论是机器的购买还是运行成本
• 三维打印技术：这项技术使用专门的打印机来创建固体物件。三维打印机将粘合剂喷射在粉末状的复合材料上，一次一层，来制造完全打印的雏形。迄今为止，大多数的支架只允许用三维细胞培养开发简单的组织结构。然而，用3D打印技术制作的定制化支架可以帮助开发更复杂的具有生物功能的组织 [58] 。
• 选择性激光烧结：这种技术使用高能激光来融合小颗粒的塑料，金属，陶瓷或玻璃粉，制成一个特定三维形状的物件。
• 熔融沉积建模（FDM）：上世纪80年代末，Stratasys发明了熔融沉积建模技术。它通常用于建模、原型设计、生产应用。在这个过程中，热的塑料或蜡通过加热的喷嘴被挤压出去，依据该部件的截面几何形状一层一层（叠加）。塑料从喷嘴出来后立即变硬并和下一层粘结。
  FDM的主要优点是维护成本低，无有毒材料，材料易变形和无需监管。而缺点则包括因薄层面积越大而导致构建时间越长，（需要）支撑物，连续运动的挤压头，以避免材料的爆沸和因温度波动而可能发生的脱层。
• 器官打印：这项技术在特殊的打印机中不使用墨水而是利用天然的细胞和物质（生长因子），来创建器官。
• 膜层叠技术：这是另一个SFF制造技术，用溶剂浇铸和盐滤等方法制备的多孔支架膜被剪切，堆叠和使用溶剂（如氯仿）进行化学结合。使用计算机辅助设计模板，可以制备具有特定形状的聚合泡沫支架，其中支架的主体性质与单层膜的相同。

方法

• 溶剂蒸发：使用这种技术制备可生物降解的羟基酸的聚合物和共聚物微球，其中的疏水性溶剂通过蒸发被除去 [66] 。
• 单双乳化技术：在单乳化技术中，聚合物首先溶解在水溶液中，随后分散在非水介质中。分散的微球用加热或化学交联剂进行交联。双乳化技术涉及多种乳剂的形成。水/非水/水的双乳化类型主要用来包含水溶性蛋白质、药物及多肽。
• 粒子聚合支架：该技术是基于预制微球颗粒的随机堆积，随后进一步物理或热聚集形成一个三维多孔结构。

微球也可以采用冷冻干燥和相态分离凝聚法制备

细胞外基质（ECM）是所有组织和器官的组成成分 [72] 。它可以利用各种组织制备，如皮肤真皮，小肠和膀胱粘膜下层，心包膜、基底膜、脱细胞的肝间质，以及脱细胞的跟腱 [73] 。细胞外基质的组成、结构和力学性能取决于其在组织和器官的位置、宿主年龄以及特定组织的生理要求。与其他支架材料相比，完整的细胞外基质的优势在于其组分中结合了各种结构性蛋白，生物活性分子，天然的三维超微结构及其独特的空间分布，这些会与细胞互作并指引细胞的命运。

整个细胞外基质（ECM）可以作为初始材料，而不是支架。脱细胞的ECM利用可利用核酸酶溶液降解，然后再悬浮，已通过冷冻干燥和其他交联技术用于制造支架，用于软骨骨髓间充质干细胞（的培养） [74] 。

方法

• 脱细胞化：细胞外基质支架主要用天然组织脱细胞的方法来制备，可利用酶、去垢剂和高渗溶液进行脱细胞。脱细胞的细胞外基质适用于心脏瓣膜 [75, 76] 、肌肉 [77] 等组织工程。

这些（生物反应器）是已经开发了的模拟体内生理环境，促进细胞生长和分化的设备。生物反应器提供了生理环境的各个方面，包括：温度；氧浓度；二氧化碳浓度；机械刺激（液流剪切力）；化学刺激；电流。

此外，灌注和剪切应力已被证明会影响三维培养干细胞的发育潜能 [86, 87] ，是模拟体内动态培养条件的重要性的基础。生物反应器已应用于胚胎干细胞聚集体的悬浮培养，维持其未分化状态 [88] 。灌注式生物反应器也已经在使用人胚胎干细胞形成稳定的骨组织移植物中显示出重要性 [82] 。

微流体装置已被越来越多地应用于三维细胞培养中。

• 水凝胶制备技术：如前所述，微流控系统被用于制备水凝胶（见第2.3.5部分） [49, 51, 96] 。将种植了内皮细胞的亚毫米大小的胶原蛋白圆筒（模块）随机组装到微流体灌注室，引导产生弯曲的由内皮细胞衬里的通道结构，用于组织工程 [97] 。
• 与支架集成：此外，在支架内应用微流体通道/网络是一个新的研究平台，用于制造组织工程支架。
  种植了内皮细胞的三维微流控网络已经被并入支架中用于促进血管化，使整个支架中充满养料和氧含量均一的液流 [98, 99] 。最近，聚（1，3-二氨基-2-羟基丙烷-共-多羟基癸二酸酯）（APS）已被用来通过改良的复制成型技术和SU-8光刻技术制造微流体通道。它们在利用内皮细胞形成微血管网方面，显示出比使用PDMS、PLGA和PGA制作的微流体通道更适合的机械，降解和弹性性能。它们的优点是：快速，廉价，可重复性和可扩大规模的制造技术 [98] 。
• 细胞培养装置：微流体装置已发展用于三维培养的自动化 [100] 。这些设备能产生不同类型细胞的复杂（组成）模式，已被用来研究血管周围干细胞微环境 [101] 的分子调控。
• 在支架上产生梯度：微流体技术在制造支架的同时也被用来产生刚度和黏附配体的梯度，微流体系统形成的胶原胶中有不可比拟的机械刚度梯度 [102] ，黏附配体（包括来源于层粘连蛋白的生物活性肽序列，YIGSR或IKVAV）的趋触性梯度，已显示能够增强定向轴突生长 [103] 。

许多支架作为可获得的商业化产品可用作研究工具和组织再生治疗，包括以下：

• 各种市售的水凝胶支架如Matrigel， Tisseel， Qgel™， ECMgel， Corgel™ BioHydrogel， and Nano Dox™。
• 各种市售的磷酸钙、硫酸钙生物陶瓷支架和生物活性玻璃胶包括bonesource®，BoneSource®， Calcibon®， ChronOS®， Eurobone®， HydroSet™， Norian SRS®， Ostim®， MIIG® X3）， and Cortoss® [104] 。
• 其他骨替代物包括Lactosorb， Calciresorb， CCerasorb， Cerasorb M， Tutogen bovine， Tutobone human， Biobon， and Perossal [105] 。
• Restore™ device and CellPatch™是两种不同的由猪小肠粘膜下层组成的材料，为市售治疗肌腱缺损的材料。
• 其他天然材料包括GraftJacket® and Alloderm（从人真皮中获得），TissueMend®（从胎牛胎皮肤获得）和Permacol™（由猪真皮组成）。
• 可作为皮肤替代物的各种成纤维细胞填充支架包括Dermagraft™， Apligraf™， Orcel™， Polyactive™ and Hyalograf 3D™。

在组织工程和再生生物材料研发中仍有许多工作需要完成。对于三维培养，支架的选择是一个关键的考虑因素，因为它提供了细胞附着和增殖的场所。生物材料能够显著影响细胞分化 [115] 。一个重要的方向仍存在着：明确生物材料和支架本身-独立于细胞培养条件（尺寸，几何形状，生长因子）-对细胞增殖和分化的影响。控制各种信号出现的空间和动态性仍然是一个挑战。三维细胞培养系统需要设计地更实际接近于体内的组织性水平。系统生物学和生物信息学相结合，模拟细胞动力学，可用于设计更复杂的三维细胞培养系统，是克服这些挑战的方法之一。