三维细胞培养:综述
Anandika Dhaliwal (anandika dot dhaliwal at gmail dot com)
Rutgers University, New Jersey, United States
译者
王秀英 (mary at labome dot com)
美国新泽西州普林斯顿合原研究有限责任公司 (Synatom Research)
DOI
http://dx.doi.org/10.13070/mm.cn.2.162
日期
更新 : 2016-05-10; 原始版 : 2012-12-26
引用
实验材料和方法 2012;2:162
摘要

三维细胞培养方法的综合评述。

英文摘要

A comprehensive review of methods for 3D cell culture.

介绍

处于三维环境中的体内细胞具有特征性的生理和生物力学信号,影响细胞迁移、粘附、增殖和基因表达等功能(图1) [2-5] 。 组织工程中特定细胞过程(如分化和形态发生)已被证明在三维环境中(3-D)比二维环境(2-D)中更容易发生 [6, 7] 。 培养在3-D聚乙二醇(PEG)水凝胶中的间充质干细胞(MSCs)与生长在组织培养塑料平皿表面相比会显著上调平滑肌特异蛋白如αSMA和平滑肌肌球蛋白的表达 [8] 。人类胚胎干细胞(hESC)在3-D中比2-D中分化成心肌细胞的效率更高,且在3-D中显著上调如MLC-2A/2V,cTnT, ANP,α-MHC and KV4。3等心脏功能特定标记物 [9] 。具有家族性阿尔茨海默氏症突变的人神经干细胞,只有在三维培养中才能重现beta淀粉样斑块和神经纤维缠结 [10] 。

三维细胞培养:综述 图 1
图 1. 三维细胞培养的示意图。

最近,含磁性氧化铁(MIO)的水凝胶已被用于处理培养细胞,细胞在含磁铁的培养基中悬浮。以这种方式,培养的细胞完全离开基于重力的基底 [1] 。磁悬浮技术已经用于开发乳房肿瘤的体外模型 [11] 。由于在体内的细胞仍然受重力影响,这种人工悬浮液对细胞代谢和行为的影响仍有待研究。在2015年,DNA程式化的细胞组装已被用于将细胞组装成想要的3三维组织 [12] 。

三维细胞培养:综述 图 2
图 2. 应用磁悬浮的三维细胞培养示意图。来源于参考文献 [1] 。

这篇综述将讨论各种三维细胞培养体系。

三维细胞培养的重要性

我们对三维细胞培养支架和模型的重要性的认识正不断加深。三维细胞培养能更准确地模拟正常的细胞形态,增殖,分化和迁移。

一个研究转变正在进行, 那就是3-D的细胞培养体系正取代2-D培养体系。在体内动物模型检测之前或作为它的一种替代方式,体外实验正逐渐从2-D转变为3-D [9, 13] 。

三维细胞培养的优势与应用
  • 三维培养体系可以利用允许对模拟的细胞微环境进行轻易操作的方法人工合成。
  • 三维培养体系可以用细胞模拟不同的疾病状态来研究疾病模型 [14] 。这也减少了对动物模型的需求。
  • 研究药物剂量的影响,体外培养的细胞在三维中比在二维中更接近现实情况,因为细胞在2-D中与3-D中对药物的反应有差异 [15] 。在3-D中,多层细胞而非(2-D中)仅仅单层细胞以及将细胞紧密结合在一起的紧密连接通过阻断或减缓影响药物的扩散,形成对药物天然屏障 [13, 14, 16, 17] 。
  • 支架可以被合成以支持三维细胞生长,同时用于生长因子、药物或基因的传送 [18-22] 。
  • 三维细胞培养在组织工程和再生医学领域有着直接的应用。
细胞支架

包含着生物信号分子的支架材料可以通过引导移植的细胞粘附、增殖以及分化或者在组织再生部位自发的细胞浸润来介导组织形成。3-D支架通常是生物兼容性的,以与组织生长相适应的速度降解和被吸收,因此决定了同化再生细胞结构的形状和功能 [23] 。 不管是合成的还是天然的3-D支架都有优于2-D表面支架的优势。虽然天然材料提供了重要的信号分子来介导生物兼容性,但他们往往缺乏合成材料的机械支持力。而复合材料则可以用来结合他们不同的优点。

材料 优势
天然的蚕丝、胶原蛋白、明胶、透明质酸、海藻酸纤维蛋白原
  • 可生物降解的
  • 容易获得
  • 具有生物活性,能够与细胞相互作用
合成的PEG,PGA,PMMA,PLGA
  • 促进受损组织结构的恢复
  • 惰性
  • 保质期长
  • 很容易订制所需的孔隙率和降解时间
  • 可预见、可重复的机械和物理性能
表一. 天然和合成材料。

目前已有很多种不同的支架使用各种各样的材料被研发出来,尤其是下面几种:水凝胶,商品化定制的支架,纤维支架,多孔支架,微球以及天然组织支架。

这些支架可利用各种制造技术来制成。然而,并没有通用的支架,使用哪种支架取决于想要实现的功能和所需的特性。

决定三维支架设计标准的一系列特性如下:生物材料;生物相容性;生物可降解性;孔隙率、孔径;几何结构;细胞共培养;形状和大小;连通性;导向性;力学性能(张力强度、弹性系数等) [24] ;加入生理信号以及储存可溶性信号的能力;包含有不同的ECM(细胞外基质)。

多孔材料

海绵或泡沫多孔支架在组织工程应用中已被广泛使用。这些材料通常具有较高的孔隙率和均质的连通结构。合成的生物可降解的聚合物如聚乳酸、PGA,PLGA,PCL,PDLLA,以及基于PEO,PBT的PEE作为多孔支架材料被使用。

多孔支架材料的制备方法:

  • 盐析法(致孔剂沥滤法):晶体盐如氯化钠(普通食盐)放入模具。然后,将聚合物倾倒在盐上,聚合物穿透盐晶体之间的空隙。待聚合物硬化后,将盐透析于溶剂中。

    也可以使用糖和蜡。它的优点包括简单,多功能性,能控制孔洞的几何形状和大小。然而,它只能产生厚至3毫米的支架并且很难获得精确的连通性。

    新一代盐致孔剂和改良的粒子浸出法正在开发中,使盐晶体尺寸精确控制在最大为几微米的一个较窄的粒径范围 [25] ,并更好地控制随之而来的孔径和孔隙率 [26] 。

  • 溶剂浇铸法:将聚合物溶解于有机溶剂中,然后将其与陶瓷颗粒混合,然后将溶液浇铸于一个预先设定的三维模具中。

    这种技术的主要优点是易于制造,简单,以及能够将药物(如抗生素,抗氧化剂)包含在支架内。主要的缺点是,只有简单的形状(如平板和管)可以制造,连通性较低。此外,它是一个耗时的技术,有毒溶剂会蛋白变形并影响其他溶剂。

  • 气体发泡法:首先将聚合物迅速搅拌形成泡沫,然后硬化,形成一个固态的海绵状物体,泡沫的气泡最终形成支架的孔隙。
    这种技术的主要优点是:它不需要任何溶剂或固体致孔剂。缺点是:在压缩成型过程中会使用过多的热量,且孔与孔之间往往不形成一个相互连通的结构。结合颗粒浸出技术能使空气发泡法制造的支架获得开放的孔隙结构。
  • 熔融成型法:聚合物分子和致孔剂在模具中混合,加热到高于无定形聚合物的玻璃化转变温度,或半结晶聚合物的熔融温度,使聚合物重组和结合。复合材料随后冷却,从模具中取出,浸泡在液体中滤出致孔剂。该技术有利于包含生物活性分子,残留的有机溶剂是不能避免的,然而该技术也有受限因素:较高的塑形温度会使生物分子变性。
  • 微球体烧结:在这个过程中,首先制备陶瓷/聚合物复合微球,然后烧结成三维多孔支架 [27] 。

通常会联合运用多种方法来制造支架。

细胞材料方法结果参考文献
血管平滑肌细胞(VSMCs)聚乳酸聚ε-己内酯 (PLCL)挤压微粒滤出
  • 细胞粘附和增殖与孔隙率和孔隙大小成正比
  • 适用于在机械动态培养条件下制造包含平滑肌的组织
[28]
人类成骨样细胞聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)和45S5生物活性玻璃(BG)微球体烧制
  • 获得所需的机械性能
  • 整合骨组织的潜能
  • 骨组织工程应用
[27]
人类间充质干细胞(hMSCs)聚ε-己内酯气体发泡

以及从共连续混合物中选择性提取聚合物

细胞克隆化,增殖和成骨分化都与孔隙结构的微架构有关 [29]
人类肝癌细胞(Hep3B)聚乳酸-乙醇酸(PLGA)超临界气体发泡与PLGA 50:50 海绵相比,PLGA 85:15海绵支持更高的细胞浸润、扩散和肝功能 [30]
淋巴细胞和SMCs聚乳酸-乙醇酸(PLGA)气体发泡/盐浸出
  • 释放地塞米松,抑制淋巴细胞和SMCs的增值
  • 适用于抗炎的多孔假肢装置
[31]
人类软骨细胞聚乳酸-乙醇酸(PLGA)和聚乙烯醇(PVA)的混合物熔模

浸提法

  • 支持细胞粘附和生长
  • 植入后,在支架中有更好的骨骼生长和骨形成。
[32]
表二. 使用多孔支架进行三维细胞培养的研究。
纤维支架

纤维支架的主要特征在于它们的纤维结构,为细胞附着提供了较大的表面积。这些支架具有较大的纤维间距离,有利于营养和气体交换以及细胞浸润。天然和合成的聚合物也被探索用来制作纤维支架。其中包括胶原、透明质酸(HA)、蚕丝、壳聚糖、PLA、PLGA、PCL、PU、和PEVA。

方法

  • 纤维网:这些支架是由独立纤维平织或编织成孔径可变的三维模式。然而,他们可能缺乏体内应用所需的结构和机械稳定性
  • 纤维粘结:这项技术的开发是为了克服纤维网的局限性,具体来说:在纤维交叉点处利用特定的溶剂,将温度加热到聚合物的熔点以上使纤维粘合。主要优点是简单、使用生物相容性材料、比毛毡和流苏样排列有结构上的优势,而缺点是不能控制孔径和孔隙率,缺乏合适的溶剂,两种聚合物组分在熔融状态不能相混融,以及所需聚合物的相对熔融温度。
  • 静电纺丝技术:这种技术通过静电喷雾多聚物材料,产生直径从亚微米到纳米级的连续纤维涂层。静电纺丝支架在神经组织工程有广泛的应用 [33, 34] 。它们主要为神经突生长和轴突延伸提供结构上的引导。此外,纤维状神经导管可以被植入受伤部位。
    静电纺丝技术具有以下优点:能够产生具有特异导向性的超精细纤维,高纵横比,高表面积和可控制的孔径,但主要受限于细胞接种。
  • 相态分离 [35] :通常用一种低熔点(容易升华)的溶剂来溶解聚合物。加入水诱导相态分离,形成聚合物的富集相和贫相。通过将温度冷却至溶剂的熔点以下得到支架,再利用真空干燥法使溶剂升华
  • 自组装 [36] :即专门设计的肽纤维自组装形成稳定和高度有序的纳米级支架。
细胞材料方法结果参考
大鼠骨髓基质细胞纤维网状骨组织工程 [37]
软骨组织聚ε-己内酯-b-聚L-乳酸(PCL-b-PLLA)热诱导相分离和盐浸出
  • 获得具有相互联通的孔隙结构(144±36μm直径)的纳米纤维丝支架
  • 适用于软骨组织工程
[35]
PC12细胞聚ε-己内酯 (PCL)电纺的支持神经突生长和延伸的纤维管状支架 [38]
胚胎阶段九(E9)的鸡背根神经节(DRGs)和大鼠施旺细胞细胞(SCs)聚乳酸电纺的促进神经突和施旺细胞沿纤维生长 [39-41]
肝细胞,人类脂肪干细胞(hASC)和血管内皮细胞(HUVEC)丝素蛋白/壳聚糖(SFCS)自组装 [42] ,双向电泳 [43]
  • 促进细胞的粘附
  • 植入后低炎症反应 [42]
  • 细胞粘附、迁移 [43]
[42, 43]
内皮细胞羟基官能团聚酯(聚羟甲基乙交酯共ε己内酯,pHMGCL)和聚ε-己内酯(PCL)的混合物同轴电纺
  • 用于传递VEGF
  • 维持功能,促进细胞粘附
[19]
人牙髓干细胞(DPSCs)聚乳酸相态分离技术和致孔剂浸出支持体外和体内成骨分化的纳米纤维支架 [44]
表三. 使用纤维支架的三维细胞培养的研究。
水凝胶

用组织状水凝胶作为支架材料引起很多的兴趣,因为它们体现了像组织一样柔度,同时具有粘弹性,间隙流动性和类似于天然组织的可扩散传送特性。用于形成水凝胶的天然高分子聚合物包括纤维蛋白原 [22, 45] ,透明质酸(HA) [17, 46] ,藻胶、胶原、明胶和壳聚糖。用于形成水凝胶的合成聚合物包括聚乙二醇(PEG)及其衍生物,聚乳酸(PLA)和聚乙烯醇(PVA)。

方法

  • 溶剂浇铸和颗粒沥虑:稍微改良过的这些方法已被用于制备水凝胶 [47] 。见上文。
  • 气体发泡:使用发泡方法制备水凝胶已经被很好地特征性描述和研究过 [48] 。见上文。
  • 冷冻干燥:这种技术基于升华原理,首先将聚合物按所需的浓度溶于溶剂中,冷冻,随后低压冻干除去溶剂。它不需要高温或分离过滤步骤,支架具有较高的孔隙率和连通性,孔径的大小可以通过调节冷冻速率和pH值来控制,它的限制因素是:处理时间长,产生孔径较小。
  • 共聚合/交联方法:其他方法包括聚合物凝胶,自由基聚合,原位聚合和光聚合。
  • 微流控芯片:使用微流控芯片制备水凝胶是一个即将出现的技术。这种技术的主要优点是,可制备具有均一孔径,孔隙率和复杂样式的水凝胶 [49] 。可重复的水凝胶三维细胞培养体系可以用微流控芯片技术实现 [50] 。
细胞材料方法结果参考
神经干细胞/前体细胞甘露醇晶体与光交联的壳聚糖混合,孔径大光聚合促进三维分化 [51]
神经肿瘤干细胞胶原蛋白,80 um孔隙凝胶化增强的附着能力,生存能力和分化(神经突生长) [52]
兔骨髓间充质干细胞聚乙二醇延胡索酸酯(OPF)以及包裹的细胞和装载TGF-β1的明胶微粒可注射的、可原位交联的和可生物降解的低聚物, 自由基聚合, 37°C 8分钟
  • 维持细胞生存14天
  • 细胞分化成软骨样细胞
[53]
HepG2肝细胞藻酸盐凝胶化支持细胞生存超过14天,维持细胞的功能和代谢 [16]
前列腺癌细胞透明质酸(HA)HA的衍生物,HAALD HAADH在PBS中共价交联和腙键的形成适用于体外抗癌药物如喜树碱、多西他赛和雷帕霉素的筛选 [17]
胰岛壳聚糖冷冻干燥法
  • 持续的三维胰岛培养
  • 细胞维持最初的形态至少53天
  • 细胞维持正常胰岛素分泌能力至少49天
[54]
主动脉SMCs聚乙二醇和胶原蛋白或纤维蛋白的共轭物光聚合持续的细胞粘附和蛋白水解降解,使细胞三维扩散和迁移 [55]
软骨细胞氮气,海藻酸水溶液,普朗尼克®F127表面活性剂微流体
  • 可制备孔隙大小均匀的支架
  • 维持细胞增殖
  • 可以用来研究孔隙和孔隙度对各种组织工程参数的影响
  • 可以制成复杂的模式
[49]
表四. 使用水凝胶的三维细胞培养研究。
定制支架/快速原型制造/固相自由形式技术

这也被称为快速原型制造或固相自由形式制造。自定义支架可以使用计算机辅助设计(CAD)来制作,即用计算机系统协助创建,修改,分析或优化一个设计。计算机辅助设计的输出形式通常是为打印或机械加工操作设计的电子文件。计算机辅助设计的输出包括形状、材料、工序和尺寸的具体信息。已经有很多不同方法利用CAD设计的数字模型来进行进一步加工。这基本上是使用附加工序来实现,即通过铺设连续的材料层制作一个物件。

方法

  • 固体光刻技术 [56] :固体光刻(或光固化)技术由Chuck Hall 在1987年获得专利。可交联的液体树脂使用紫外线或可见光诱发光聚合,使用激光栅格或动态遮光的方法一次(制作)一个二维截面层。层层光固化的聚(乙二醇)二甲基丙烯酸酯 (能被光交联)已被证明能够帮助配体,细胞外基质(ECM)成分、生长因子和控释颗粒的精确排布 [57] 。该技术能够制作预先设计的内部结构和孔隙。
    这种技术的其他优点是较短的建立时间,使用动态遮光的方法,设备成本低,无论是机器的购买还是运行成本
  • 三维打印技术:这项技术使用专门的打印机来创建固体物件。三维打印机将粘合剂喷射在粉末状的复合材料上,一次一层,来制造完全打印的雏形。迄今为止,大多数的支架只允许用三维细胞培养开发简单的组织结构。然而,用3D打印技术制作的定制化支架可以帮助开发更复杂的具有生物功能的组织 [58] 。
  • 选择性激光烧结:这种技术使用高能激光来融合小颗粒的塑料,金属,陶瓷或玻璃粉,制成一个特定三维形状的物件。
  • 熔融沉积建模(FDM):上世纪80年代末,Stratasys发明了熔融沉积建模技术。它通常用于建模、原型设计、生产应用。在这个过程中,热的塑料或蜡通过加热的喷嘴被挤压出去,依据该部件的截面几何形状一层一层(叠加)。塑料从喷嘴出来后立即变硬并和下一层粘结。
    FDM的主要优点是维护成本低,无有毒材料,材料易变形和无需监管。而缺点则包括因薄层面积越大而导致构建时间越长,(需要)支撑物,连续运动的挤压头,以避免材料的爆沸和因温度波动而可能发生的脱层。
  • 器官打印:这项技术在特殊的打印机中不使用墨水而是利用天然的细胞和物质(生长因子),来创建器官。
  • 膜层叠技术:这是另一个SFF制造技术,用溶剂浇铸和盐滤等方法制备的多孔支架膜被剪切,堆叠和使用溶剂(如氯仿)进行化学结合。使用计算机辅助设计模板,可以制备具有特定形状的聚合泡沫支架,其中支架的主体性质与单层膜的相同。
细胞材料方法结果参考文献
人类间充质干细胞聚乙二醇的树脂三维微立体光刻
  • 方法简单
  • 提供在X,Y和Z平面上的控制
  • 维持细胞生存能力高达7天
[56]
人类脐静脉内皮细胞(HUVECs)明胶丙烯酸甲酯(GelMA)投影立体光刻(PSL)
  • 可以定制的机械性能
  • 均一的细胞分布和增殖
  • 保持细胞表型
[59]
骨髓干细胞聚乙醇酸(PGA),聚乳酸(PLA)三维打印、正负模具交换技术
  • 细胞浸润到支架
  • 良好的细胞相容性
  • 适用于颅颌面骨缺损修复
[60]
13 - 93玻璃与硬脂酸混合(作为聚合物粘结剂)选择性激光烧结(SLS)
  • 出色的非承载应用
  • 能够支持活跃的细胞生长
[61]
C2C12成肌细胞聚已酸内酯(PCL)选择性激光烧结(SLS)
  • 保持培养细胞21天
  • 可以定制适用于软组织工程的机械性能
  • 可以制备不同孔隙大小的支架
[62]
内皮祖细胞和骨髓基质细胞(BMCs)水凝胶器官或组织打印(三维纤维沉积绘图仪,生物画图仪)
  • 细胞生存能力没有受到挤压条件的影响
  • 细胞能够进行成骨分化
  • 适用于包含多种细胞类型的骨移植物的开发
[63]
成骨细胞和软骨细胞聚已酸内酯(PCL)熔融沉积造型
  • 持续的骨软骨共培养
  • 适用于骨软骨缺损修复
[64]
人类间充质干细胞(MSCs)纤维蛋白、聚合物(PCL)、磷酸钙陶瓷(CaP)熔融沉积造型
  • 支持细胞附着、迁移和成骨分化
  • 相比于PCL支架,增加了27倍降解速率。
[65]
表五. 使用定制支架进行三维细胞培养的研究。
微球

方法

  • 溶剂蒸发:使用这种技术制备可生物降解的羟基酸的聚合物和共聚物微球,其中的疏水性溶剂通过蒸发被除去 [66] 。
  • 单双乳化技术:在单乳化技术中,聚合物首先溶解在水溶液中,随后分散在非水介质中。分散的微球用加热或化学交联剂进行交联。双乳化技术涉及多种乳剂的形成。水/非水/水的双乳化类型主要用来包含水溶性蛋白质、药物及多肽。
  • 粒子聚合支架:该技术是基于预制微球颗粒的随机堆积,随后进一步物理或热聚集形成一个三维多孔结构。

微球也可以采用冷冻干燥和相态分离凝聚法制备

细胞材料方法结果参考文献
软骨细胞明胶微粒聚集,+ / - TGF-β1粒子聚合,直径:10µm
  • 支持软骨细胞的存活和功能
  • 应用于软骨组织工程
[67]
兔髓核细胞(NP)胶原蛋白微球
  • 保持圆形和表型
  • 细胞重塑模板胶原蛋白基质
[68]
脂肪组织来源的间充质干细胞壳聚糖粒子聚合
  • 无细胞毒性,支持细胞增长
  • 有助于成骨和软骨分化
  • 骨软骨双层支架可以开发
[69]
Y7视网膜母细胞瘤(RB)细胞聚乳酸-乙醇酸(PLGA)微粒溶剂蒸发,直径: 145-162 µm适用于作为评估化疗药物的体外模型 [15]
乳腺癌细胞PLGA / PLA微粒子溶剂蒸发
  • 包含聚乙烯醇(PVA)矩阵结构(PLA-PVA)和血清预处理的PLA微粒支持良好的细胞粘附和细胞生长
  • 适用于评估抗癌药物
[15]
脂肪来源干细胞壳聚糖油包水乳化过程以及一个离子凝聚技术
  • 支持细胞粘附和迁移
  • 可用作胶原蛋白凝胶的细胞载体
[70]
癌细胞(MCF-7细胞)(搅拌悬浮生物反应器培养)聚乳酸-乙醇酸(PLGA)水/油/水双乳液法
  • 维持癌细胞培养
  • 可用作癌细胞移植的载体,(检测)体内肿瘤形成。
[71]
表6. 使用微球支架进行三维细胞培养的研究。
天然支架

细胞外基质(ECM)是所有组织和器官的组成成分 [72] 。它可以利用各种组织制备,如皮肤真皮,小肠和膀胱粘膜下层,心包膜、基底膜、脱细胞的肝间质,以及脱细胞的跟腱 [73] 。细胞外基质的组成、结构和力学性能取决于其在组织和器官的位置、宿主年龄以及特定组织的生理要求。与其他支架材料相比,完整的细胞外基质的优势在于其组分中结合了各种结构性蛋白,生物活性分子,天然的三维超微结构及其独特的空间分布,这些会与细胞互作并指引细胞的命运。

整个细胞外基质(ECM)可以作为初始材料,而不是支架。脱细胞的ECM利用可利用核酸酶溶液降解,然后再悬浮,已通过冷冻干燥和其他交联技术用于制造支架,用于软骨骨髓间充质干细胞(的培养) [74] 。

方法

  • 脱细胞化:细胞外基质支架主要用天然组织脱细胞的方法来制备,可利用酶、去垢剂和高渗溶液进行脱细胞。脱细胞的细胞外基质适用于心脏瓣膜 [75, 76] 、肌肉 [77] 等组织工程。
细胞材料方法结果参考文献
人类脂肪干细胞京尼平交联的软骨衍生基质
  • 使用京尼平产生收缩自由的生物材料
  • 软骨形成
[78]
尿来源干细胞分化而成的尿道上皮细胞与平滑肌细胞的混合培养物小肠粘膜下层(SIS)支架去细胞的5% 过乙酸(PAA)三维细胞基质的多层粘膜结构的增长和发展 [79]
人类脐静脉内皮细胞(HUVECs),SMCs(灌注生物反应器中动态培养)小口径猪颈动脉酶和去垢剂去细胞适用于小口径血管移植重建疗法 [80]
猪动脉内皮细胞(脉冲式的生物反应器系统)猪主动脉心脏瓣膜化学萃取法脱细胞,经五-没食子酰基葡萄糖 (PGG)处理使其稳定适用于开发组织工程心脏瓣膜(TEHVs),重构和细胞重新集群的能力 [81]
hESC来源的间充质前体细胞(中级灌注生物反应器)骨小梁酶和去垢剂去细胞形成大而致密骨结构,能够在体内维持稳定8周 [82]
人类胎儿肝细胞(FH-hTERT),人类初始肝细胞整个小鼠肝脏使用去垢剂脱细胞用作肝细胞移植的载体 [83]
晚二期/早三期胎儿肾脏外植体成年恒河猴肾使用去垢剂脱细胞
  • 支持Pax2+ /波形蛋白+细胞的吸附和迁移
  • 需要研究与一系列其他细胞的再细胞化
  • 适用于肾组织工程
[84]
表七. 使用天然支架的三维细胞培养研究。
各种支架的比较
支架优势缺点
多孔支架
  • 高孔隙率
  • 相互关联的结构
  • 简单,易于制造
  • 使用高毒性溶剂
  • 低的孔隙连通性
  • 支架制成后的同质细胞接种存在困难
  • 高度多孔支架会有弱的机械性能
  • 缺乏支架厚度的控制
纤维支架
  • 纤维网格和纤维结合是简单的技术
  • 大的表面面积/体积比率
  • 对营养和气体交换有高的纤维距离
  • 通过自我装配可以形成稳定、高度有序的支架
  • 纤维网格缺乏机械完整性
  • 纤维结合缺乏孔隙度和孔隙大小的控制
  • 如电纺等制造过程中产生的小孔隙限制了移植后的细胞浸润和3维细胞整合
水凝胶
  • 组织灵活性等
  • 粘弹性
  • 肠道内流和扩散转移
  • 更高的成本
  • 非粘附以及体内测试通常需要第二层防护以保证安全
  • 天然高分子水凝胶,如胶原蛋白明胶、海藻酸和琼脂糖可能会引发炎症反应
定制的支架(CAD技术)
  • 可控制的基质结构:大小、形状、连通性、分支、几何和取向
  • 可以控制孔隙和孔隙大小
  • 力学性能和降解动力学可控
  • 可重复的体系结构和成分的变化
  • 当前系统的低分辨率
  • 只能用选择性的高分子材料
微球
  • 当使用生物可降解和无毒材料制作时可作为细胞载体 [70]
  • 大的表面积用于细胞附着和增长
  • 适用于在搅拌悬浮生物反应器中的三维细胞培养
  • 一旦注射或植入很难除去
  • 微球/珠子有未知毒性
天然/ ECM支架模拟细胞的自然微环境如组成、生物活性的信号和机械性能
  • 难以控制去细胞化的程度和保留所有ECM
  • 细胞分布不均匀
  • 去细胞化不完全时会有免疫原性 [85]
表八. 概述各种支架的优点和缺点。
生物反应器

这些(生物反应器)是已经开发了的模拟体内生理环境,促进细胞生长和分化的设备。生物反应器提供了生理环境的各个方面,包括:温度;氧浓度;二氧化碳浓度;机械刺激(液流剪切力);化学刺激;电流。

此外,灌注和剪切应力已被证明会影响三维培养干细胞的发育潜能 [86, 87] ,是模拟体内动态培养条件的重要性的基础。生物反应器已应用于胚胎干细胞聚集体的悬浮培养,维持其未分化状态 [88] 。灌注式生物反应器也已经在使用人胚胎干细胞形成稳定的骨组织移植物中显示出重要性 [82] 。

细胞材料和方法结果参考文献
小鼠睾丸精细胞软琼脂基质和灌注生物反应器完整的精子发生 [89]
原代人类肝细胞
  • 基于多室毛细管膜生物反应器的
  • 灌注培养
  • 10天内保持稳定的细胞功能。
  • 基于肝药物代谢的药理研究的适用系统。
[90]
人类间充质干细胞
  • 三维灌注生物反应器
  • 聚乙烯对苯二酸酯(PET)纤维矩阵。
  • 四室每个有三个矩阵。
  • 集成接种操作
  • 适用于多种组织工程构件的生产
  • 可大规模生产的、易操作。
  • 保持hMSCs多谱系分化的潜力
[91]
胚胎干细胞(ESCs)两级灌注纤维床生物反应器系统
  • 在小型生物反应器内促进产生数十亿的ESCs,使用2-态工序,不需要提供ECM蛋白质和生长因子。
  • 可扩大规模,适用于生产大量的ESCs。
[92]
人类平滑肌细胞(SMC)
  • 管状弹性聚碳酸环丙烷(PTMC)支架
  • 生物反应器种脉冲式的流动条件
  • 动态培养的SMC结构表现得比静态培养的好
  • 适用于制备组织工程血管移植物的中层结构
[93]
软骨祖细胞(CPCs)
  • 旋转血管壁(RWV)生物反应器
  • pC-HAp / ChS(多孔材料包括胶原蛋白、羟磷灰石和硫酸软骨素)支架
CPCs能够形成有弹力的软骨样组织 [94]
胚胎干细胞(ESCs)搅拌悬浮生物反应器(SSBs)
  • 形成拟胚体
  • 分化成心肌细胞
[95]
表九. 使用生物反应器的三维细胞培养研究。
微流体系统

微流体装置已被越来越多地应用于三维细胞培养中。

  • 水凝胶制备技术:如前所述,微流控系统被用于制备水凝胶(见第2.3.5部分) [49, 51, 96] 。将种植了内皮细胞的亚毫米大小的胶原蛋白圆筒(模块)随机组装到微流体灌注室,引导产生弯曲的由内皮细胞衬里的通道结构,用于组织工程 [97] 。
  • 与支架集成:此外,在支架内应用微流体通道/网络是一个新的研究平台,用于制造组织工程支架。
    种植了内皮细胞的三维微流控网络已经被并入支架中用于促进血管化,使整个支架中充满养料和氧含量均一的液流 [98, 99] 。最近,聚(1,3-二氨基-2-羟基丙烷-共-多羟基癸二酸酯)(APS)已被用来通过改良的复制成型技术和SU-8光刻技术制造微流体通道。它们在利用内皮细胞形成微血管网方面,显示出比使用PDMS、PLGA和PGA制作的微流体通道更适合的机械,降解和弹性性能。它们的优点是:快速,廉价,可重复性和可扩大规模的制造技术 [98] 。
  • 细胞培养装置:微流体装置已发展用于三维培养的自动化 [100] 。这些设备能产生不同类型细胞的复杂(组成)模式,已被用来研究血管周围干细胞微环境 [101] 的分子调控。
  • 在支架上产生梯度:微流体技术在制造支架的同时也被用来产生刚度和黏附配体的梯度,微流体系统形成的胶原胶中有不可比拟的机械刚度梯度 [102] ,黏附配体(包括来源于层粘连蛋白的生物活性肽序列,YIGSR或IKVAV)的趋触性梯度,已显示能够增强定向轴突生长 [103] 。
商业化可用的三维细胞培养系统/支架

许多支架作为可获得的商业化产品可用作研究工具和组织再生治疗,包括以下:

  • 各种市售的水凝胶支架如Matrigel, Tisseel, Qgel™, ECMgel, Corgel™ BioHydrogel, and Nano Dox™。
  • 各种市售的磷酸钙、硫酸钙生物陶瓷支架和生物活性玻璃胶包括bonesource®,BoneSource®, Calcibon®, ChronOS®, Eurobone®, HydroSet™, Norian SRS®, Ostim®, MIIG® X3), and Cortoss® [104] 。
  • 其他骨替代物包括Lactosorb, Calciresorb, CCerasorb, Cerasorb M, Tutogen bovine, Tutobone human, Biobon, and Perossal [105] 。
  • Restore™ device and CellPatch™是两种不同的由猪小肠粘膜下层组成的材料,为市售治疗肌腱缺损的材料。
  • 其他天然材料包括GraftJacket® and Alloderm(从人真皮中获得),TissueMend®(从胎牛胎皮肤获得)和Permacol™(由猪真皮组成)。
  • 可作为皮肤替代物的各种成纤维细胞填充支架包括Dermagraft™, Apligraf™, Orcel™, Polyactive™ and Hyalograf 3D™。
材料产品供应商组分细胞系结果参考文献
MatrigelInvitrogen重构的富含层粘连蛋白的基底膜前列腺癌细胞系有用的培养体系,适用于抗癌和抗迁移化合物的预测性测试 [14]
TisseelBaxter Healthcare Corp., BioScience纤维蛋白胶试剂盒人类间充质干细胞(hMSCs)细胞增殖,成骨分化 [106]
GraftJacketWright Medical Technology, Inc.人真皮
  • 生物相容性
  • 与宿主组织相整合
  • 适用于增强肌腱修复
[107]
Corgel™ BioHydrogelLifecore Biomedical基于透明质酸的水凝胶软骨细胞
  • 水凝胶能抗透明质酸酶消化而保持稳定
  • 生物相容性的
  • 保持封装细胞的代谢活动
[108]
ChronOS®Synthesβ-磷酸三钙(100%)人类外周血单核细胞(PBMCs)在最初依赖于材料的培养上清液的pH值变化,破骨细胞多核化和生物材料吸收之间存在显著的相关性 [105]
Mozaik®Integra Orthobiologics20%的I型胶原蛋白+ 80%磷酸三钙成骨细胞适用于骨再生的成骨支持支架 [109]
Absorbable Collagen Sponge (ACS)Medtronic Sofamor DanekI型胶原蛋白成骨细胞适用于骨再生和骨科治疗 [109-111]
AlgiMatrix™Invitrogen藻酸盐
  • 人类胚胎干细胞(hESCs)
  • 心肌细胞
  • 形成血管化拟胚体
  • 适用于心源共培养物的开发
[112-114]
表十. 使用商品化支架进行三维细胞培养研究的例子。
未来的挑战

在组织工程和再生生物材料研发中仍有许多工作需要完成。对于三维培养,支架的选择是一个关键的考虑因素,因为它提供了细胞附着和增殖的场所。生物材料能够显著影响细胞分化 [115] 。一个重要的方向仍存在着:明确生物材料和支架本身-独立于细胞培养条件(尺寸,几何形状,生长因子)-对细胞增殖和分化的影响。控制各种信号出现的空间和动态性仍然是一个挑战。三维细胞培养系统需要设计地更实际接近于体内的组织性水平。系统生物学和生物信息学相结合,模拟细胞动力学,可用于设计更复杂的三维细胞培养系统,是克服这些挑战的方法之一。

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ISSN : 2329-5147