水藻生物燃料研究方法
Kimberly DelTorchio (kimdeltorchio at gmail dot com)
Melbourne, Florida, USA
译者
王秀英 (mary at labome dot com)
美国新泽西州普林斯顿合原研究有限责任公司 (Synatom Research)
DOI
http://dx.doi.org/10.13070/mm.cn.3.167
日期
更新 : 2015-02-01; 原始版 : 2013-03-31
引用
实验材料和方法 2013;3:167
英文摘要

An overview of Algae biofuel research methodology

引言

随着传统石油燃料供应量的减少,对可持续燃料的生产需求日渐增长。促使这一研究进行的其他因素包括降低对进口石油的依赖和减少温室气体的排放。现在,人们已经从麻疯树、油菜籽、棕榈树、玉米等作物上获得燃料,以满足对能源的需求 [2] 。这些植物作为传统的粮食作物,必须得种在陆地上。就算地球上所有可用于种植作物的陆地都用来生产来自于高等植物的燃料,也满足不了全世界所需能源的一半。

微藻类作为生物能源的给料有几大优势。它无需耕地,耗水量也少于其他作物。微藻类能将60%以上的体重转化为脂类。据估计,在相同的土地面积上,微藻类生产的油类是其他作物的15-300倍。

水藻生物燃料研究始于美国能源部下属的国家可再生能源实验室的水生物种计划。这个项目探索了使用微藻类生产生物燃料的诸多方面。通过筛选,对不同水藻生产脂类的能力进行了测定。为了筛选出适宜作为燃料给料的水藻,超过3000株藻类接受了这一测试。另外,还对微藻类进行了基因修饰。

水藻是一个大型、异质化的光和生物群体,从类似细菌的单细胞生物到肉眼可见的植物样的海藻,都属于藻类。不像真正的植物,即使是多细胞藻类也没有纤维素和维管系统。它们的生存环境包括淡水、咸水、海水甚至是极端环境。

几乎所有的水藻都能产生脂类,占生物质重量的1%-85%。在低氮条件下,一个“脂触发”过程让某些藻类开始在细胞内积聚脂类。这种现象倾向于在低氮条件下发生,此时营养物质被耗尽,细胞停止分裂。微藻类产生的脂类通常为三酰甘油,又称TAG。TAG通常被转化为脂肪酸甲酯,即FAME,FAME是一种生物柴油。

培养条件能改变脂含量和生产率。微藻类在富含营养物质的水中生长得更旺盛。例如,有一种小球藻,异养条件下含油量55%,而自养条件下含油量仅14%。一些被寄予希望作为生物燃料给料的关键种类及其特征列于表一中。

种名 脂含量
(% 生物质干重)
脂生产能力
(毫克/升/天)
生物质体积生产能力
(克/升/天)
生物质面积生产能力
(克/平方米/天)
纤维藻24.0-31.011.5-17.4
布朗葡萄藻25.0-75.00.023.0
牟勒氏角毛藻33.621.80.07
普通小球藻5.0-58.011.2-40.00.02-0.200.57-0.95
小球藻18.0-57.018.73.50-13.90
绿球藻19.353.70.28
寇氏隐甲藻20.0-51.110
盐生杜氏藻6.0-25.0116.00.22–0.341.6–3.5/ 20–38
后棘藻27.447.30.17
纤细裸藻14.0-20.07.70
等鞭金藻7.1-3337.80.08-0.17
微球藻20.0-56.060.9-76.50.17-0.51
微拟球藻12.0-53.037.6-90.00.17-1.431.9-5.3
富油新绿藻29.0-65.090.0-134.0
三角褐指藻18.0-57.044.80.003-1.92.4-21
斜生栅藻11.0-55.00.004-0.74
中肋骨条藻13.5-51.317.40.08
四列藻12.6-14.743.40.30
表一:关键种属及其特征一览。

为了筛出一株水藻,需要在无菌条件下,在实验室中进行分离、纯化和培养。理想的株系拥有高脂含量,高生长速率,高脂生产率,高TAG比率(即产生的所有脂类中TAG含量较高),能耐受较宽泛的pH、温度和盐度范围,能从污水中吸收二氧化碳,并创造出可行的副产品 [2] 。

本文对以水藻为给料生产生物燃料的方法进行了回顾。图1所示为利用藻类生产生物柴油的方法的步骤。

水藻生物燃料研究方法 图 1
图 1. 水藻生产生物柴油的步骤。如果采用一步直接的酯交换反应,提取步骤可绕过。
水藻的培养

培养水藻以生产生物燃料的方法既简单又复杂。作为自养生物,它们仅需水和阳光即可存活。然而,为了培育出高密度的微藻类以获取生物燃料,还需要营养物质。尽管空气中含有二氧化碳,高浓度的二氧化碳能促进更高的生产率。

促进水藻生长的培养基是整个培养过程中的一个重要的组成部分。缺乏一个各种营养物质配比正好的培养基,水藻无法高密度生长。除了常量营养素氮(N)和磷(P),其他藻类生长所需的元素还包括钾(K)、钙(Ca)、硫(S)、镁(Mg)、铜(Cu)、锰(Mn)和锌(Zn)。氮对蛋白质和碳水化合物代谢非常重要,如果缺乏,细胞停止分裂,产物从蛋白质转化成脂类。铁对正常的光合作用而言是必须的。如果缺乏镁,细胞将丢失叶绿素。如果S不存在,细胞将无法分裂 [3] 。对海洋水藻而言,制备培养基时,包含氯化钠也是非常重要的。一些常见的培养基成分列于表二中。

培养基名称 关键组分 参考文献
M-8KNO3, KH2PO4, CaCl2, Fe EDTA, FeSO4*7H20, MgSO4*7H20 [3]
Bold 3NNaNO3, CaCl2·2H2O MgSO4·7H2O, K2HPO4,KH2PO4, NaCl, 土壤提取物
ComboCaCl2*2H20, MgSO4*7H20, K2HPO4, NaNO3, NaHCO3, Na2SiO3 9H2O, H3BO3, KCl
BG-11KH2PO4, MgSO4*7H2O, CaCl2*2H20, 柠檬酸, 柠檬酸铁铵(绿色), NaEDTA
f/2NaNO3, NaH2PO4*H2O, Na2SiO3*9H2O [4]
表二:常见的水藻培养基。

剥夺水藻细胞的氮可能会导致它们积聚脂类,但是据观察,生物量会随着脂类的增多而减少。当氮供应量减少时,其他限制因素,如光照,需要增加以维持生物量 [5] 。这样细胞开始减少蛋白质含量增加碳水化合物含量,氮对蛋白质的合成而言是必须的,但对碳水化合物而言就不那么重要了。当剥夺了重要的常量营养素后,光合作用以较低的速率进行。

除了使用培养基,本来用于传统作物的商品肥料也能作为营养物。提取油脂后,剩下的生物质可以用于作为肥料 [6] 。另一种培养基的来源是如木薯一类的给料。作为一种碳源,这种淀粉植物在降低成本的同时,能产生高密度的水藻。废水,本来含氮量和含磷量就很高,使用它们来培养水藻时,可以减少额外添加的营养物质的量。但这可能会导致脂含量降低,除非使用混合培养基。

水藻的培养通常从实验室的无菌条件下开始。第一步是获得一株纯化分离的所需株系。水藻可从现场采集,或者从菌种保藏中心预订,如德克萨斯州立大学菌种保藏中心。接着,水藻便可以生长于锥形瓶中或用于接种大玻璃瓶。小规模生产时,通常使用人工照明。若要长期生长,也可将水藻培养在水平培养皿或斜面培养基上。

如果规模较大,有两种主要的反应器用于培养水藻。第一种是光生物反应器,它是封闭的。另一种反应器是开放式的,通常为一敞池或水沟。这两种反应器通常都额外注入或混有二氧化碳,以增强其生产率,有些将两种反应器混合着用。它们都有光穿透方面的问题。表三列举了这两种反应器某些方面的特质,包括优势、劣势和使用条件。

反应器类型 光生物反应器,如管式或平面式 敞池,如水沟或静态池塘
混合叶轮
光照条件内部照明,控制光周期太阳光照明,允许光穿透的深度为0.1-0.3 m
优点可控制光周期,污染风险小,高产相对便宜,低能耗,使用当地资源
缺点污垢,过热,明暗区污染物,蒸发损失水份,池塘生态环境波动
常见问题解决方案洒水以防止过热使用适应极端环境的品种,一次性培养防止污染
参考文献 [7] [8]
表三: 两种主要的大规模微藻类培养反应器之比较。

为了选择一种对水藻而言最适合的系统,以下几个因素必须考虑,如气候,培养的藻类以及能提供的营养物质。在凉爽的环境中,过热不太会成为一个问题,那么管形的PBR可能是培养水藻的最佳选择。在热带环境,靠近一大片水域的水沟也许更适合,它能够满足对水的需求。还有一种选择是将PBR和水沟结合起来。早晨水藻培养在PBR中,下午则移至更凉爽的水沟。到了晚上,再移回PBR。PBR和敞池还能结合起来用于生命周期的不同阶段。基本上每个池塘都接种有PBR培养物。池塘接种一段时间后,就需要采收了。或者是因为细胞数目达到了顶峰,或者是因为池塘被污染了。此时应先清理池塘,然后再接种PBR中的水藻。

水藻的采收

采收是通往可行的生物染料的一项艰巨的任务。它被认为是从水藻中获得生物燃料的最耗能最昂贵的一步。发现一种能量效率高的方法是一个重要的研究方向。采收方法包括机械法、化学法和电解法。采收方法列于表四中。

方法 描述 材料 优点 缺点 参考文献
离心机械法,通过离心力除去水份离心机高回收率,高固体量,无化学物质污染对能源需求高,剪切力损伤细胞
过滤让水藻通过膜,固体留下,培养基通过过滤器,抽气泵高回收率,低能源需求,无化学物质污染也许需要重稀释(脱水),滤膜上可能出现污垢 [9]
絮凝除去使细胞分开的静电能垒后使细胞聚集絮凝剂,如NaOH、壳聚糖、氯化铝对细胞的损伤较离心法少,低能源需求,高效化学物质污染已采收的水藻,盐水藻类难以絮凝 [10]
浮选通过气泡让水藻浮至表面,撇去表层,通常与絮凝方法相结合絮凝剂、气体涡轮、集水杯对细胞无损伤,简单,低能耗对密度高的培养物可能效果较差
超声分离声波致使细胞聚集超声波发生器,谐振器,泵除去大部分的水份,对细胞无损伤,系统不产生污垢高能量输入,高成本,细胞浓缩效果不如其他采收方法
电解法电极导致细胞凝结,细胞于是从悬浮液中脱离电极低能量输入,无污染物,培养基可回收利用电极可能会被弄脏
表四:常用的微藻类采收方法。

过滤产生的污垢可以通过几种不同的方法得到解决。超滤通过用海水对膜进行反向回洗解决了过滤的这一缺点,防止污垢的发生 [1] 。

水藻生物燃料研究方法 图 2
图 2. 超滤单位示意图 [1] 。

另一种收获方法解决了微滤和浮选中的问题。通过结合这俩个方法,浮选中的气泡可解决过滤时的结垢问题。

脱水

如果采收方法以离心或过滤为主,脱水常常是必不可少的,这些方法所致的生物质大约含90%的水份。除水,或者干燥水藻将除去大部分的水,浓缩生物质。日光干燥是最省钱的方法,但需要大量时间和空间。另一种低能耗的脱水方法是用天然气干燥炉。

脱水也可以在泡罩塔中进行。使用泡沫浮选法,水藻吸附至气泡上形成聚集物。再通过机械混合,聚集物与液体分离。可以重复这一步以继续浓缩水藻,然后再用微孔滤膜处理。

溶气浮选法也可作为一种脱水方法。再加上絮凝,这一方法也可以很有效地除去大部分水份。气泡粘附在颗粒上,表面积增加使之更便利,因此添加了絮凝剂。聚集的细胞表面粘附的气泡增加了其浮力,于是细胞浮到了表面。如果气泡过大,会导致絮凝体破裂,因此为了产出适宜大小的气泡,该方法需用到饱和罐。浮选机中充满气泡,聚合的细胞会不定时地被采收。

提取脂类

细胞采收后,脂类必须从细胞中提取出来。为了实现这一步,细胞壁必须破碎,但并不提取其他部分。和采收一样,有机械、化学和物理法。提取方法列于表五中。

方法 描述 注释 参考文献
均质化水藻通过小的阀门被排出,以此破坏细胞壁通常作为提取步骤的预处理,无化学污染
珠磨法将水藻置于装有小珠的容器中,搅拌以破坏细胞无化学污染 [7]
Bligh和Dyer法确定水容量后,用2:1配比的甲醇:氯仿溶液均质样品,并用氯仿和水冲洗。形成两相,收集脂质相。对于脂含量大于2%的样品而言并不精确,原本用于提取鱼磷脂。 [11]
Folch法水藻与2:1配比的氯仿:甲醇溶液混合,使其分层。冲洗脂相并收集,然后干燥。原本用于提取脑组织中的脂类。被认为是脂提取的标准方法。 [12]
索格利特萃取法将已称量好的样品置入索格斯利特萃取器中,并添加溶剂。缓慢提取出脂类并干燥之。可能是个漫长的过程。 [13]
超临界法通过施加高压和高温产生超临界液体,超临界液体拥有两种性质。它拥有液体的密度和气体的可压缩性。将水藻置于浸提器中,超临界液体通过容器,然后排出至空气中。二氧化碳格外受瞩目。可以用温度来选择特定的液体,因为它对可溶性有影响。
超声波裂解法超声能产生气泡,当气泡破裂时,细胞壁也破裂。无化学污染 [14]
亚临界水水加热至沸腾,施压,产生一种溶剂。常用于高等植物 [15]
微波法微波用于在极性溶剂中产生能量,除去水份以破坏细胞壁。是一种快捷的方法
表五:从微藻类中提取脂类的方法。

自Folch和Bligh、Dyer法后,溶剂提取脂类的方法已得到广泛的研究。通常,细胞会被预处理,如均一化、冻干或烘干,以增加提取效率。溶剂系统包括氯仿和甲醇1:1的混合液,通常还会用两种或更多种提取方法除去大多数的脂类。索格利特萃取法也需要用到溶剂,如图5所示。不幸的是,大多数的溶剂提取法可能会污染终产物,使其含有不想要的化学物质。机械法的优点在于它们不留下任何不需要的残留物质。

水藻生物燃料研究方法 图 3
图 3. 索格斯利特萃取器示意图。

超临界二氧化碳法也无残留物质。它可能对非极性物质如TAG有选择性。与溶剂提取法(如正己烷作为溶剂)相比,产量虽较低但脂肪酸概况表明仅有非极性脂类。这可能会导致更高的整体效率,因为要制成生物柴油,极性脂类必须转化为非极性。为了进行超临界二氧化碳流体抽提,需要一部二氧化碳通过的抽提机。所需组分包括液体源,如二氧化碳,一个将液体送至浸提器的泵,以及一个浸提器。一个加压和加热液体的压缩机。液体源或者是直列式气缸或者是离线的容器,不断被泵入液体源。一个分离容器接受提取出来的脂类。图4所示为超临界二氧化碳系统的示意图。

水藻生物燃料研究方法 图 4
图 4. SC-CO2提取系统示意图:V1,V2,和V3,停汽阀;F,过滤器;CV,止回阀;HC,加热线圈;E,浸提器;CT,循环加热器;PM,压力计;MV,微调阀。
转化为燃料

整个创造可使用燃料方法的最后一步是将TAG转化为脂肪酸甲酯(FAME),即柴油燃料的组成成分。将TAG转化为FAME的过程是一种酯交换反应。在这一反应中,一种简单的醇类如甲醇被加入脂类中。催化剂,如NaOH,也会用到。反应在容器中边搅拌边进行,生成FAME及一种甘油副产品。

水藻生物燃料研究方法 图 5
图 5. 酯交换反应生成脂肪酸甲酯(所需产物)和甘油(副产物)。

如果反应中使用了超临界乙醇,那么催化剂就不一定需要用了,但也可以使用以绕过提取这一步。超临界乙醇法是这样进行的:向干燥的水藻中添加甲醇,90º C加热40分钟,以促使超临界反应发生。混合有助于分离过程。

在提取过程中,微波和超声有助于酯交换反应的进行。如果选择超声,将4 mL 10:1配比的甲醇和硫酸置于超声波清洗器内10分钟。为了让反应发生,上述物质接着在80º C烘箱内烘烤2小时,再加入3 mL正己烷。离心后,收集含FAME的上清液,可重复该过程若干次,达到最大化回收FAME。如果选择微波提取,微波辐射产生热量和压力,导致细胞壁破裂。向干燥的水藻中加入催化剂,再用X射线照射 [16] 。这种方法的一大优点是相对简单,且仅需一步。

生产可使用的生物柴油的最后一步是除去副产物甘油,及任何其他可能存在的污染物。甘油的密度大约为1050 kg/m3,而生物柴油的密度为880 kg/m3,因此,可以用重力沉降或离心的方法除去甘油。通常会通过加入蒸馏水除去大多数的污染物,包括肥皂、残留的催化剂以及甲醇。烷基酯用于干燥生物柴油和除去多余的水份。酸中和催化剂和可能形成的肥皂。然后用水冲洗。生物柴油可以用10% H3PO4冲洗,接着再用水冲洗。硅胶和酸式硅酸镁可用于吸附污染物。污染物可以用膜除去。

评估燃料

为了达到不同政府和国际监管机构的标准,终产物必须经过评估。在欧洲,其标准为EN 14214和EN 14213;在美国,标准为ASTM D 6751。ASTM(美国测试和材料标准)D 6751中必须测试的变量列于表三中。燃料的这些性质可以预测其可用性以及储存和运输的稳定性。每个批次生产的生物柴油通常都需要出具含上述性质和脂肪酸概况的报告。

在酯交换反应步骤中,所用的醇类、催化剂、副产物甘油、残余的TAG和自由的脂肪酸都会污染终产物。这是最大的污染来源,因此质量控制的第一步就是检测这一步骤。

甘油是酯交换反应的副产物,应被除去。其他污染物包括游离的甾醇、生育酚和甾醇糖苷。这些污染物可能会影响燃料质量,通常是可溶的。

检测生物柴油的化学性质的方法列于表六中。化学成分包括脂类,如TAG、FAME和污染物。

方法 描述 详细资料 本方法适宜评估的化合物 参考文献
气相色谱根据沸点和化合物的极性分离样品溶解样品,然后注入气相色谱。通过某成分洗脱所需时间来鉴定它。脂肪酸概况,甲醇,甘油,甾醇,生育酚,甾醇糖苷
液相色谱根据在溶剂中溶解度的不同,依靠重力分离化合物与HPLC相似,不能认为是精确的与气相色谱结合,污染物
高效液相色谱根据在溶剂中溶解度的不同,依靠机械泵分离化合物泵让溶剂推动样品进入一个很窄的柱子,柱子通常充满了小而密的颗粒。生育酚,甾醇糖苷
质谱分析凭借能量源,使样品分子质子化。通过静电加速和磁场摄动区分离子脂肪酸概况
核磁共振某些原子核,如1H和13C,用于激发分子的核自旋状态。通过原子在分子中所在的不同位置对其进行计数脂肪酸概况 [17]
近红外光谱红外光较可见光能量低,频率低,波长长。当红外光被吸收后,它使得分子被激发,因此能够被识别出来。脂肪酸概况
表六:检测生物柴油化学性质的方法。
物理性质评估

生物柴油的物理性质会影响燃料在发动机中的表现,因此需要被测定。ASTM并没有对所有的物理性质作出要求,但欧洲标准(EN 14214)要求出具相关报告。表七列出了ASTM标准中必须检测的生物柴油的物理性质,它们的定义和用于测定这些性质的标准方法。

性质 ASTM 定义 方法
比重检测密度通过液体比重计检测
运动黏度表示液体在重力作用下流动时内磨擦力的量度通过生物柴油样品通过玻璃毛细管所需的时间来度量。运动黏度 = 时间 x 校正常数
闪点D 93检测可燃性,提示乙醇含量将生物柴油样品放置在烧杯内,通过外部加热。到达闪点,一束火焰会穿出烧杯
蒸馏温度D 1160又称沸点生物柴油的沸点在大气温度下很高,因此需在真空下进行。
十六烷值D 613无单位,检测效能单缸间接喷射式发动机在900 rpm下吸入150º F温度的空气,待测燃料在发动机内工作,产生13º的标准着火滞后期。十六烷值 = % n-十六烷 + 0.15 (% 七甲基壬烷)
浊点D 2500液体冷却过程中蜡晶体开始析出的温度冷却燃料,观察混浊。
铜条腐蚀D 130样品中存在腐蚀物质的指示剂将铜条置于50º C样品中3小时,然后与对照组的铜条比较
酸值D 974燃料质量的重要因素样品燃料用含KOH的异丙醇溶液滴定,以p-napththolbenzoin作为指示剂
硫酸灰分D 874检测所含润滑油及金属燃烧样品燃料至仅剩灰分和碳。向残留物中加入硫酸,并加热。冷却后重复该步骤。然后加热样品至恒重。
焦炭残渣D 4530检测燃料的结焦倾向康氏残炭测试。取10 g样品置于坩埚内,将此坩埚再置于另一铁坩埚,然后加热30分钟。称量样品。
钠、钾、钙和镁含量UOP 391可致肥皂形成可以用质谱仪或电感耦合等离子体发射光谱分析
氧化稳定性测定特定的酯的含量,燃料的储存稳定性样品燃料加热至110º C,持续冒泡。通过样品的电导率测定其氧化速率。
水含量D 2709冲洗过程中可能会引入水份,对燃料有害离心
沉淀物含量D 2709沉淀物可阻碍燃料的流动离心
表七:ASTM和EN标准中柴油需要测试和报告的物理性质。
水藻生物柴油的挑战与未来

水藻生物柴油拥有巨大的潜力,但依然有许多可以改进的地方。这可能会影响水藻的生命周期和整个生产生物柴油的方法。既然这是一种能源产品,那么降低生产生物柴油所需的能耗将是最大的挑战。每个步骤都需要更多的数据以说明它如何影响整个过程的生命周期。生命周期分析有助于测定脂类生产过程的能量需求。这一分析对于终产品的经济和能量可行是至关重要的。

因此需要开发一套系统,或遗传工程改造过的藻类,使其既有高生物量又有高脂含量 [18] 。了解藻类使用特定营养物质的方式和产生脂类所表达的基因能改进所培养的藻类。旨在创造出拥有所需性质的转基因水藻株系的研究正在进行之中 [19] 。这些所需的性质包括光合效率、最优的脂类概况和积聚脂类的同时依然高产。

更有效更廉价的提取方法也是必须的。因为甘油这种副产物的产量如此之高,它必须得安全储存或使用,才能使得酯交换反应生产生物柴油切实可行。甘油是肥皂的一种成分,但如果巨量生产生物柴油,那么伴随而来的甘油将很快使市场难以消化。

q提取脂类后留下的水藻粉可以转化为糖类或者发酵成乙醇。这可以代替玉米生产乙醇,也将会更廉价和易于制备。提取碳水化合物后,剩下的水藻粉就主要是蛋白质了。余下的生物质还可作为肥料。

依靠碳排放为藻类提供二氧化碳能够解决水藻培养所需的一个条件,还能降低成本。以及螯合排放出的温室气体。使用生长在废水中的水藻作为燃料给料可以有效处理污水,达到净化的目的 [18] 。成本占比最大的项目之一是营养物质,大量的营养物质,尤其是N和P,对水藻的生长至关重要。如果废水能提供这些营养同时水藻又将N固定,那么还能防止水华。在一些地方,这可以变成一种服务,从废水中除去含氮物质,成为卫生系统的一部分。

本文列举的方法详细描述了以水藻为原料生产可使用的燃料的方法。尽管仍有相当多的挑战,但是水藻作为给料生产生物燃料的方法拥有巨大的潜力。

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