详细了解许多生物过程需要表达和纯化重组蛋白。固相金属亲和层析（IMAC）是一种有力的手段，可以高效快速的纯化用短的亲和标记物（包含多组氨酸残基）标记的重组蛋白。IMAC的概念是由Porath等人 [4] 第一次提出并示范的。从那时起，IMAC就被广泛的用于纯化各种各样的His标记蛋白，并且在免疫吸附试验和芯片试验中也得到了重要的应用 [5] 。

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图 1. 固相金属亲和层析（IMAC）的示意图。

IMAC是以固定在基质上的金属离子和组氨酸侧链的相互作用为基础。组氨酸显示出与金属离子如Co²⁺, Ni²⁺, Cu²⁺和Zn²⁺的强相互作用。组氨酸咪唑环易与这些金属离子形成配位键。这些金属离子以螯合基（如亚氨基二乙酸（IDA）或次氮基三乙酸（NTA））通过一个长的亲水性垫片固定在基质上，这个垫片能确保金属离子易与组氨酸标签接触。组氨酸标记的蛋白选择性地高效地固定在层析柱基质中，pH为7到8。标记的蛋白很容易通过降低pH而洗脱掉，而通过逐渐降低pH可以获得最佳的纯化效果。咪唑与组氨酸竞争结合金属离子，因此常常用改变咪唑的浓度来洗脱想要的蛋白。

表达系统如大肠杆菌、啤酒酵母、杆状病毒感染昆虫细胞以及哺乳动物细胞已经用于纯化多组氨酸标记的蛋白。多组氨酸标签，由六个组氨酸残基组成，常用于亲和纯化，长的或短的标签都已被成功的使用。多组氨酸标签可以放置在蛋白的N端或C端，也可以放置在蛋白的内部任何适当的位置。重要的是该标签很容易与金属离子相互作用，多组氨酸标签的最优配置依赖于兴趣蛋白。因为多组氨酸标签很小，它通常不影响蛋白的功能。但是，如果蛋白用于质谱分析或蛋白结晶，那么就需要将标签去除。在克隆载体上设置蛋白酶剪切位点，就可以在蛋白纯化后轻易的去除标签。可溶性的多组氨酸标记蛋白可以在天然条件下进行纯化。但是聚合蛋白或包涵体形式的蛋白需要在变性条件下利用尿素或盐酸胍进行纯化，不影响标签与金属离子的亲和力 [6] 。

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图 2. 使用铕标记的供体抗体和APC标记的受体抗体TR-FRET试验。

IMAC提供了一个强大而灵活的方法来纯化蛋白，是应用最广泛的层析方法之一。多组氨酸标签很容易添加到兴趣蛋白上，在单一的纯化步骤中很少影响蛋白的功能，且能保证蛋白的高纯度和良好的复原。其主要缺点是在基质上和随后的洗脱过程中与其他蛋白的非特异性结合。哺乳动物蛋白常常含有连续的组氨酸残基，因此通常会遇到这种问题。非特异性疏水作用还会导致纯化的蛋白含有杂质。缓冲液中添加非离子去污剂、氯化钠、甘油或乙醇能够减少非特异性结合 [6] 。多组氨酸标签很容易与同一蛋白上的其他标签结合。多标签系统能够允许在多种条件下进行纯化，以提高蛋白的纯度和产量。

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图 3. VMP001-NPs共聚焦显微镜图，用抗His-tag和荧光二抗孵育，以检测表面结合的VMP001颗粒。比例尺：10m。复制自图1（C） [1] 。

抗多组氨酸抗体

商业化的抗多组氨酸抗体是多克隆或单克隆抗体。小的多组氨酸标签不具有免疫原性，因此需要结合到载体蛋白上，以引起宿主的免疫反应。血蓝蛋白（KLH）是一种常用的载体蛋白。它是在软体动物巨型钥孔虫（大锁孔帽贝）体内发现的一个大的、多亚基的、不均匀糖基化的携氧蛋白。它具有高度致免性，提供多个与小标签结合的潜在位点。因为软体动物与常用的模型系统的进化较远，使用KLH作为载体蛋白可以显著的减少交叉反应和假阳性。

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图 4. 在不同鼠AD脑和人AD脑的标签斑块中检测scFV和对应的全IgG的功能。石蜡切片用22C4 scFv（A，C，E，G，I）固定，用抗His和抗兔Cy3抗体检测，或用22C4 IgG（B，D，F，H，J）固定，用抗鼠Cy3抗体直接检测。APPswe/PS1（A和B），ArcAbeta （C和D），APPswe/PS1dE9（E和F），人AD（G和H），WT（I和J）。在所有检测的组织中，scFV和全IgG都识别斑块。比例尺：200m。复制自图2（A到J） [2] 。

抗多组氨酸抗体适用于免疫印迹、免疫吸附试验（ELISA）、免疫荧光试验和免疫沉淀反应。该抗体还能与磁珠结合进行免疫沉淀反应，或与辣根过氧化物酶（HRP）结合进行免疫印迹、斑点杂交或ELISA，直接对组氨酸标记的蛋白进行免疫组织化学和免疫细胞化学检测。与某些染料结合的抗多组氨酸抗体还能用于时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）试验。FRET的基础是当供体和受体相距很近时，供体和受体分子之间会有能量转移。在FRET试验中，抗多组氨酸标记的抗体可以与供体和受体染料相结合。用铕（Eu）螯合物标记的抗多组氨酸抗体可以作为供体分子。铕螯合染料具有格外长的发射寿命，因此非常适用于均相延迟FRET测定。抗多组氨酸抗体还可以与受体染料别藻蓝蛋白（APC）结合。APC很庞大，可以形成一个空间位阻。PerkinElmer公司提供ULight作为一种替代物，ULight是一个小的受体染料，它的光谱性质与APC相似。

Labome调查了使用不同供应商提供的抗多组氨酸抗体的文章。下面是对这些抗体的应用的一个简短论述。

Santa Cruz 抗组氨酸抗体（1：1000）用于western blot，通过对抗果蝇的组蛋白去乙酰基酶Rdp3以证明小成虫芽（Lid）组蛋白H3赖氨酸4脱甲基酶可能起转录激活剂的作用 [7] ；用于western blot和免疫沉淀，以证明一氧化氮可以调节球蛋白SUMO化和Pias3稳定化 [8] ；用于western blot，以研究Sef和TAK1的相互作用，TAK1调节JNK的激活和细胞凋亡 [9] 。Santa Cruz Biotechnology抗组氨酸抗体（SC-804）用于western blot和免疫沉淀，以研究转录因子Runx2和Stat3beta的物理相互作用，此物理相互作用可以通过生长激素（GH）的刺激而增强，抑制Runx2转录活性 [10] 。此供应商的抗六聚组氨酸抗体（H15克隆）用于western blot，以研究E4B 对FEZ1的影响及在神经突生成中的作用 [11] 。

GE Healthcare抗组氨酸抗体用于western blot，以鉴定ERAD中一种新的erasin-ubiquilin-p97/VCP复合体及其功能 [12] ，抗组氨酸单克隆抗体用于western blot，以证明在大肠杆菌内，一些mRNA 合成后没有被翻译，而是被转运到蛋白质需要的位置处 [13] 。

New England Biolabs抗组氨酸抗体用于western blot，以证明在大肠杆菌内，一些mRNA能够被转运到蛋白质需要的位置处，而不被翻译 [13] 。Cell Signaling Technology鼠抗His6X单克隆抗体用于western blot，以研究啤酒酵母中人CTP合成酶的表达 [14] 。

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图 5. rPvDBPII蛋白表达和复性。考马斯染色的SDS-PAGE胶（A）M=蛋白大小标签，rPvDBPII=再折叠蛋白，rPvDBPII+DTT=用10mM二硫苏糖醇（DTT）处理的变性蛋白。红细胞结合试验（B）结果，Duffy阳性和阴性红细胞吸附后的再折叠rPvDBPII。结合试验通过将红细胞与再折叠蛋白孵育，反应混合物用邻苯二甲酸二丁酯分层，离心收集红细胞。用300mM NaCl将结合蛋白从红细胞上洗脱下来，每个孔里添加等量的蛋白。rPvDBPII蛋白用HRP标记的抗His单抗经western blot进行检测。注意再折叠蛋白形成两条带，可能表示蛋白折叠过程中的微量变性。复制自图S1 [3] 。

可以。使用含有离子和非离子洗涤剂的缓冲液可以成功的纯化多组氨酸标记的膜蛋白。

纯化组氨酸标记的蛋白时，如何消除未标记蛋白的非特异性结合？

与兴趣蛋白形成二硫键可能导致共洗脱。在缓冲液中添加2-巯基乙醇通常能够解决这个问题。非特异性相互作用还可导致杂质蛋白的共洗脱。添加非离子洗涤剂能够显著减少非特异蛋白的结合。

大多数抗组氨酸抗体都识别N端和C端标记的多组氨酸标签，以及内部标记的标签。详细内容请参考供应商的网站。大多数供应商还会列出他们的抗体最适合哪种程序。许多供应商还会提供客户支持服务，回答关于特定程序、抗体浓度及故障的疑问。

多条带通常是非特异性结合的结果。降低抗组氨酸抗体或二抗或两者的浓度通常能够减少非特异性结合。在一抗和二抗溶液中添加少量溶剂如Tween-20，也可以消除western blot多条带的问题。还可以在洗液中添加Tween-20，增加洗涤次数。

使用抗体时需着重考虑交叉反应性，但这个问题通常可以通过改变试验条件而成功的解决。但是一些哺乳动物蛋白含有两个或多个连续的组氨酸残基，可能被抗组氨酸抗体识别从而导致交叉反应。