抗体有效期/怎样储存抗体
王秀英 (mary at labome dot com)
美国新泽西州普林斯顿合原研究有限责任公司 (Synatom Research)
译者
王秀英 (mary at labome dot com)
美国新泽西州普林斯顿合原研究有限责任公司 (Synatom Research)
DOI
//dx.doi.org/10.13070/mm.cn.2.120
日期
更新 : 2018-11-17; 原始版 : 2012-10-12
引用
实验材料和方法 2012;2:120
摘要

有关存储抗体和抗体保质期的全方位讨论。

英文摘要

A thorough discussion about antibody storage and antibody shelf life.

抗体由于性质和所使用的储存条件不同,其存储的“保质期”可能从几周到几年不等。一些诊断性抗体被证明经过12-26年在4°C的储存能保持其功能 [2] 。每个抗体存储的最佳条件是独特的,然而我们还是可以总结抗体存储的一些建议和一般准则。抗体的储存时间取决于抗体固有的性质和储存条件。抗体(尤其是酶)必须存放在适当的温度和pH值范围。为了维持蛋白质的活性,以及防止其聚集,经常保存在一定浓度(~1M)的甘油,蔗糖,或类似的物质里面。表一总结了抗体储存的一般准则以及其他的注意事项。

水, 4°C25-50%的甘油或乙二醇,-20°C冻结在-20 - -80°C或在液氮冻干1
典型的保质期1个月1年内多年多年
抗体浓度1-5 mg/ml1-5 mg/ml1-5 mg/ml1-5 mg/ml
稀释载体蛋白BSABSABSA没有
消毒或抗菌的要求没有没有
抗氧化剂2-ME, DTT22-ME, DTT2没有没有
荧光共轭避光保存避光保存避光保存避光保存
pH值7.2-7.67.2-7.6
金属螯合剂EDTAEDTA
表一:抗体贮存条件。 1详细讨论见下文; 2也可用蛋氨酸。
储存条件
实验室设备
冰箱

不要用没有霜冻的冰箱来储存需要零度以下保存的抗体。一般的家用冰箱是没有霜冻的,而且它们通过反复的自动解冻来防止霜冻的形成, 因此不可用一般的家用冰箱。

储存容器

带有标记的抗体应该储存在黑色瓶子里或者用锡箔纸包住瓶子。

温度

蛋白质的氧化和水解降解等化学修饰在常温下就会发生; 然而,这些反应在高温下更加明显。一般来说,抗体最好存放在≤4℃的清洁,灭菌的玻璃或塑料管。贮存在室温下通常会由于微生物的生长导致抗体退化和/或失活。抗体储存液放在4℃环境中1天或者几周内其活性不会受到明显影响。在典型配方pH值为6.0且温度为40°情况下储存2周,多达39%的抗体分子Fv热点中的Asp / Asn残基被改变 [3] 。

抗体有效期/怎样储存抗体 图 1
图 1. 叠氮化钠在不同浓度下抑制的革兰氏阴性细菌的生长。来自[16560767]。
抗冻剂:甘油和乙二醇

冰晶的形成能够破坏蛋白质的结构,因此导致抗体失效。甘油或乙二醇等防冻剂可以防止水分子之间氢键的形成,加入到溶液中可以降低其的凝点。所以,溶液的凝点取决于抗冻剂的组成和浓度。具体的凝点见表二。

102030405060708090100
甘油-2-5-10-16-22-34-38-19-217
乙二醇-4-7-15-23-34-48-51-45-29-12
表二:甘油和乙二醇在水中不同浓度(百分比%)的凝固点(摄氏度)。

注意: 乙二醇是有毒性的,使用的时候一定要注意安全。

当储存温度低于抗体溶液真实的凝点的时候,抗体溶液就会凝固。但是,这个时候并不会形成冰晶,而是发生了玻璃化作用,其可以保持抗体结果完整性。

为了增加抗体的稳定性,可以向抗体中加入终浓度为50%的甘油或乙二醇储存于-20℃。通常为了避免反复冻融,可以分装抗体。

因为普通甘油中含有微生物污染,所以使用无菌的甘油显得尤为重要。

储存和运输的干冰使用

最近的研究表明蛋白的储存和运输常用的干冰可引起存储液的酸化, 最终导致蛋白聚集或沉淀 [4] 。 这个问题在酸性蛋白(这些蛋白在pH小于7)上更明显。多克隆IgG抗体倾向于呈酸性,pH为4.7-7.5 [5] 。因此,蛋白和抗体必需储存在气密封的小瓶和/或气密封的塑料袋里,以尽量减少干冰酸化的问题。

灭菌和杀菌剂

抗体制剂应通过使用0.45微米的过滤器过滤和消毒的,并且其必须进行无菌处理,以防止微生物污染。

抗微生物药物,如终浓度为0.02-0.05%(W/V)的叠氮化钠(NaN3)或终浓度为0.01%(W/V)的硫柳汞或终浓度为0.02%的ProClin可以抑制微生物的生长。

抗体有效期/怎样储存抗体 图 2
图 2. 叠氮化钠未能抑制革兰氏阳性细菌的生长。来自[16560767]。

叠氮化钠对于大多数细胞和组织是有毒的 [6] 。但是,叠氮化钠对革兰氏阳性菌(链球菌,肺炎球菌,乳酸杆菌)没有很大的毒性(参见图二) [1, 7, 8] 。叠氮化钠能抑制线粒体电子传递链中细胞色素氧化酶的活性还能诱导例如RGC-5细胞的凋亡 [9] 。在叠氮化钠溶液中抗体不应该被直接用在活细胞中,或体内的研究。此外,叠氮化钠干扰大多数共轭反应。叠氮化钠可以通过凝胶过滤或透析清除。

硫柳汞含有汞,吸入、摄入和皮肤接触后毒性很大,可能会引起某些人群的过敏反应。

ProClin 300的有效成分是5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮和2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮,它们是Krebs循环中α-酮戊二酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶和NADH脱氢酶的抑制剂。根据供应商之一Sigma的资料,在推荐的使用浓度(0.03 - 0.05%)下不存在健康危害、毒理学问题或处置问题,因此被认为是叠氮化钠和硫柳汞的安全替代品。它也不抑制抗体结合。

蛋白酶抑制剂

蛋白酶抑制剂可以防止蛋白质水解。由于腹水和血清制试中都含有蛋白酶,所以储存这类抗体和制剂的时候加入蛋白酶抑制剂尤为重要。冷藏和/或加入蛋白酶抑制剂可用于防止这种降解。

抗体浓度

抗体浓度过低(<1毫克/毫升)更容易发生抗体的失活以及增加物理吸附造成的损失。因此,我们都要尽量的保持抗体在储存期间的高浓度,例如,1-5毫克/毫升。通常的做法是添加“载体”蛋白质,如纯化牛血清白蛋白(BSA)以防止这种降解和损失。通常的做法是添加“载体”或“填充”蛋白质,如纯化牛血清白蛋白(BSA)将抗体浓度稀释到蛋白终浓度为1-5毫克/毫升(0.1-0.5%)。载体蛋白能保护抗体免于降解、非特异性吸附和表面张力影响。

储存和运输的干冰使用

最近的研究表明蛋白的储存和运输常用的干冰可引起存储液的酸化, 最终导致蛋白聚集或沉淀 [4] 。这个问题在酸性蛋白(这些蛋白在pI小于7)上更明显。多克隆IgG抗体倾向于呈酸性,pI为4.7-7.5 [5] 。因此,蛋白和抗体必需储存在气密封的小瓶和/或气密封的塑料袋里,在重平衡样品的同时尽量减少对抗体的破坏。来自3M的Dri-Shield防潮袋,Thermo Scientific™Nunc™Cryoflex的产品以及0203PM56OZETN和05MP081OZE等的IMPAK袋都很有用。

抗氧化剂

氧化对抗体分子尤其是对治疗性抗体的影响已被广泛研究。当抗体暴露于强光和/或高温时,抗体链中的蛋氨酸残基往往是氧化的主要位点 [10] 。抗体含有链内和链间二硫键。常用的抗氧化剂如2-ME和DTT可能无法阻止二硫键重排 [11] ,而另一种抗氧化剂蛋氨酸不会促进二硫键重排,因此它可能是抗体储存中更好的抗氧化剂(Mark Fitchmun,Somatek,圣地亚哥,美国)。

冻干

冷冻干燥(冻干)是长期稳定储存那些在液体中不稳定的单克隆抗体的方法。与其他方法相比,冻干可在较低温度下干燥抗体、减少对抗体的破坏并保持分子完整性。该方法延长了抗体的保质期、降低了运输的温度要求、并保留了抗体的化学和生物学性质。如果在-20°C或更低温度下保存,冻干的抗体可稳定保存3 - 5年而不会失去活性。通常,抗体应该冻干储存并在使用前进行重建。冻干的抗体可以通过加入去离子水或蒸馏水并在室温下将容器倒置5-6次来重构。重构的抗体可以在2-8℃下储存数周或在-20℃或更低的温度下储存1 - 2年。

处于干燥固态下抗体的稳定性对pH敏感 [12] 。pH在决定冻干状态下IgG1的物理稳定性中起主导作用,在pH为5.0时最稳定。抗体在低pH值下有更多的聚集体和二级/三级结构变化 [12] 。因此,在蛋白质配方中通常需要缓冲盐来控制pH并使其在冷冻干燥期间的降解最小化。残基含水量在维持抗体稳定性方面起着关键作用。Chang等发现纯IgG1抗体在中等水含量(2%-3%)时具有最佳稳定性 [13] 。含水量最低不一定是最佳条件,残基含水量应在配方开发中优化。

蛋白质在没有稳定剂的情况下冻干后会变性,通常形成分子间β-折叠结构。将不同的稳定剂如糖(蔗糖和海藻糖是最常用的稳定剂)或多元醇(甘油和山梨糖醇)加入到配方中以保护单克隆抗体在冻干和储存期间免于降解。配方中蔗糖有助于保持固态蛋白质的天然结构,并在长期储存期间抑制其物理不稳定性 [13] 。由于无定型甘露醇在冻干期间不能结晶而潜在地形成多元醇与蛋白质侧链间的氢键相互作用,从而增强蛋白质的稳定性。二糖/甘露醇配方在保持天然结构方面优于单独甘露醇配方的结果证明了,与单独的糖或多元醇相比,糖与多元醇的组合在防止聚集方面更有效。在基于蔗糖的配方中添加少量山梨糖醇可以更好地保留蛋白的天然结构并提高其稳定性 [13] 。

糖或多元醇对蛋白的稳定效果通常取决于它们的浓度。糖/多元醇浓度增加到一定水平最终会达到稳定作用的极限或甚至在冻干期间使蛋白质不稳定,因此冻干单克隆抗体的储存稳定性需要稳定剂与蛋白质的浓度处于一个特定的摩尔比。许多稳定性研究是通过使用等渗浓度的糖(例如275mM蔗糖或海藻糖)进行的。Jeffrey等人发现糖与蛋白质的摩尔比为360:1可以给rhuMAb HER2提供足够的储存稳定性,并且糖浓度比制剂中通常使用的等渗浓度低3-4倍 [14] 。冻干期间用于保护蛋白质的稳定剂的浓度取决于稳定剂配方的组成、浓度和物理性质,以及其与蛋白质的相容性。在选择合适摩尔比的糖混合物的条件下,通过冷冻干燥可以在室温或更高温度下长期储存抗体。

在干燥过程中糖稳定蛋白的机制是糖能产生玻璃状基质来限制流动性(玻璃动力学机制)和/或糖能充当水的替代物(水替代机制)。大多数研究支持后一种机制。水和蛋白质之间的相互作用对蛋白质的构象稳定性至关重要。当水在干燥期间被除去时,稳定剂可以像水分子那样与蛋白质形成氢键,从而在冻干过程中保留蛋白质的天然结构。

冻干是在室温下实现抗体长期储存的良好选择。但是问题仍然存在。蛋白质在冻干和/或长期储存期间可能变得不稳定。冻干是一种效率低、能耗高、设备投资大的方法。在制备抗体时没有简单的通用方案,大多数情况下仍然需要反复试验。

蛋白质中的芳香氨基酸残基可以吸收紫外线,并且光能够诱导IgG1中Trp转化为甘氨酸和甘氨酸氢化过氧化物 [15] 。抗体溶液中的化学物质如Tween 80等清洁剂可能会给抗体带来额外的光敏性 [16] 。因此,不建议对抗体进行长时间光暴露(尤其是紫外线) [17] 。

机械应力:涡旋,摇动和小瓶滴落

抗体,实际也包括一般蛋白质,当受到涡旋、摇动和小瓶滴落的机械应力时,会聚集和降解 [18-20] 。这至少部分是由于蛋白质在空气中的空化和暴露 [20] 。

多克隆抗体

多克隆抗体在血清中于-20℃保存十年其活性损失不大。然而,一旦抗体被纯化后,储存在50%的甘油中于-20℃保存,即使没有冻融,其活性的损失也可以观察到,尽管其进程仍然非常缓慢。即使没有甘油,只要你不反复冻融,抗体也可以存储在-20℃几年甚至几十年。另一个重要的事情是,该抗体浓度应高于1毫克/毫升,因为稀的抗体容易失去活性而且容易造成物理吸附导致的损失。

单克隆抗体

单克隆抗体可以保存在50%的甘油存放于-20℃。也可以将其保存在饱和硫酸铵于4℃或-20℃保存。多年未见有失活、细菌滋生以及氧化。而冻干法(冷冻干燥,干燥或从冰冻状态)为一些冰冻以后不稳定抗体提供了一种替代的保存方法。在大多数情况下,冻干的抗体最好是存放在-20℃。虽然冷冻干燥有许多优点,它需要昂贵的设备和劳动力。

带标记的抗体

带标记的抗体一般储存在黑色容器中或者用锡箔纸盖住。

酶标记抗体

碱性磷酸酶和其他酶结合物对于冷冻特别敏感,一般应在4°C短期存储。

标记抗体长期保存最好是在终浓度为50%的甘油或乙二醇中于-20°C保存。虽然某些酶结合物可在无保护剂的情况下于-20°C储存,但必须分装,以防止反复冻融。辣根过氧化酶(HRP)结合的抗体可以储存在来自马、成年牛、小牛或兔的浓度20-30%血清中,或储存在许多单一商业稳定剂或两者的混合物中(Oded Babai,Savyon Diagnostics,Israel)。

荧光标记抗体

荧光遇光容易分解,荧光标记的试剂(不只是抗体)必须避光保存,其应该存放在4°C、避免让其凝固。抗体暴露在光线下可能会导致性能不佳以及不同分装之间的差异。例如,因为2017年仓库中的高强度照明,BD Biosciences罕见地召回了荧光标记的抗体试剂 [21] 。

参考文献
  1. Lichstein H, Soule M. Studies of the Effect of Sodium Azide on Microbic Growth and Respiration: I. The Action of Sodium Azide on Microbic Growth. J Bacteriol. 1944;47:221-30 pubmed
  2. Argentieri M, Pilla D, Vanzati A, Lonardi S, Facchetti F, Doglioni C, et al. Antibodies are forever: a study using 12-26-year-old expired antibodies. Histopathology. 2013;63:869-76 pubmed 出版商
  3. Sydow J, Lipsmeier F, Larraillet V, Hilger M, Mautz B, Mølhøj M, et al. Structure-based prediction of asparagine and aspartate degradation sites in antibody variable regions. PLoS ONE. 2014;9:e100736 pubmed 出版商
  4. Murphy B, Swarts S, Mueller B, van der Geer P, Manning M, Fitchmun M. Protein instability following transport or storage on dry ice. Nat Methods. 2013;10:278-9 pubmed 出版商
  5. Szenczi A, Kardos J, Medgyesi G, Zavodszky P. The effect of solvent environment on the conformation and stability of human polyclonal IgG in solution. Biologicals. 2006;34:5-14 pubmed
  6. Chang S, Lamm S. Human health effects of sodium azide exposure: a literature review and analysis. Int J Toxicol. 2003;22:175-86 pubmed
  7. Lichstein H, Soule M. Studies of the Effect of Sodium Azide on Microbic Growth and Respiration: II. The Action of Sodium Azide on Bacterial Catalase. J Bacteriol. 1944;47:231-8 pubmed
  8. Lichstein H. Studies of the Effect of Sodium Azide on Microbic Growth and Respiration: III. The Effect of Sodium Azide on the Gas Metabolism of B. subtilis and P. aeruginosa and the Influence of Pyocyanine on the Gas Exchange of a Pyocyanine-Free Strain of P. aer. J Bacteriol. 1944;47:239-51 pubmed
  9. Ji D, Kamalden T, Del Olmo Aguado S, Osborne N. Light- and sodium azide-induced death of RGC-5 cells in culture occurs via different mechanisms. Apoptosis. 2011;16:425-37 pubmed 出版商
  10. Lam X, Yang J, Cleland J. Antioxidants for prevention of methionine oxidation in recombinant monoclonal antibody HER2. J Pharm Sci. 1997;86:1250-5 pubmed
  11. Liu Y, Chen X, Enk J, Plant M, Dillon T, Flynn G. Human IgG2 antibody disulfide rearrangement in vivo. J Biol Chem. 2008;283:29266-72 pubmed 出版商
  12. Park J, Nagapudi K, Vergara C, Ramachander R, Laurence J, Krishnan S. Effect of pH and excipients on structure, dynamics, and long-term stability of a model IgG1 monoclonal antibody upon freeze-drying. Pharm Res. 2013;30:968-84 pubmed 出版商
  13. Chang L, Shepherd D, Sun J, Tang X, Pikal M. Effect of sorbitol and residual moisture on the stability of lyophilized antibodies: Implications for the mechanism of protein stabilization in the solid state. J Pharm Sci. 2005;94:1445-55 pubmed
  14. Cleland J, Lam X, Kendrick B, Yang J, Yang T, Overcashier D, et al. A specific molar ratio of stabilizer to protein is required for storage stability of a lyophilized monoclonal antibody. J Pharm Sci. 2001;90:310-21 pubmed
  15. Haywood J, Mozziconacci O, Allegre K, Kerwin B, SCHONEICH C. Light-induced conversion of Trp to Gly and Gly hydroperoxide in IgG1. Mol Pharm. 2013;10:1146-50 pubmed 出版商
  16. Singh S, Zhang J, O Dell C, Hsieh M, Goldstein J, Liu J, et al. Effect of polysorbate 80 quality on photostability of a monoclonal antibody. AAPS PharmSciTech. 2012;13:422-30 pubmed 出版商
  17. Du C, Barnett G, Borwankar A, Lewandowski A, Singh N, Ghose S, et al. Protection of therapeutic antibodies from visible light induced degradation: Use safe light in manufacturing and storage. Eur J Pharm Biopharm. 2018;127:37-43 pubmed 出版商
  18. Kiese S, Papppenberger A, Friess W, Mahler H. Shaken, not stirred: mechanical stress testing of an IgG1 antibody. J Pharm Sci. 2008;97:4347-66 pubmed 出版商
  19. Telikepalli S, Kumru O, Kalonia C, Esfandiary R, Joshi S, Middaugh C, et al. Structural characterization of IgG1 mAb aggregates and particles generated under various stress conditions. J Pharm Sci. 2014;103:796-809 pubmed 出版商
  20. Randolph T, Schiltz E, Sederstrom D, Steinmann D, Mozziconacci O, SCHONEICH C, et al. Do not drop: mechanical shock in vials causes cavitation, protein aggregation, and particle formation. J Pharm Sci. 2015;104:602-11 pubmed 出版商
  21. BD Research Reagent Product Notice. 来自: bdbproductnotice.com/us/
ISSN : 2329-5147