An overview of FITC/fluorescein, and its applications in biomedical research based on a survey of 118 formal publications.
荧光素是一种应用非常广泛的荧光示踪物。在水中,其最大吸收/发射波长为521/494纳米。荧光素的衍生物异硫氰酸荧光素(FITC)带有异硫氰酸反应基团,使其朝着对生物分子常有的胺和巯基进行反应。
截至2011年8月19日,来邦网(Labome)调查了使用FITC/荧光素或者FITC标记的试剂的80篇文献。荧光最常见的应用是与 二次抗体的结合和检测细胞凋亡。此外,许多其他基团可与FITC结合,并且复合物被应用在许多实验中。
在 流式细胞和免疫荧光(包括了 免疫细胞化学和 免疫组织化学)实验中,荧光素通过与不同的二抗(一个简单的二抗调查和简要的FITC介绍能在 找到)相结合,使得其成为了普遍用到的记物之一。
Life Technologies公司(也称为Molecular Probes, Invitrogen, Biosource International, Zymed Laboratories)FITC标记的二抗用在流式细胞术或者免疫细胞化学实验中研究GDAP1表达 [1] ,冠形病毒HKU1感染下HLA-C的作用 [2] ,CD63在肾和溶酶体功能的作用 [3] ,莱伯先天性黑朦动物模型 [4] ,和Smad4蛋白在毛囊干细胞维持中的作用 [5] 。
来自于BD Biosciences(BD Pharmingen)的FITC结合的抗小鼠或者抗兔的二抗,用在流式细胞术和免疫细胞化学中,来研究IL-17免疫缺陷 [6] 、化学增活素在细胞归巢中的作用 [7] 、CD63在肾脏和溶酶体中的功能 [3] 、自噬在细胞凋亡中的影响 [8] 、和LRRK2的亚细胞定位 [9] 。
Jackson Immunoresearch Laboratories是专注于二抗的试剂供应商。 FITC标记的二抗用在免疫组化和免疫细胞化学,研究果蝇的CREB结合蛋白在染色体功能中的作用 [10] 、HMGN1对ATM活化的影响 [11] 、Hif-alpha/Notch相互作用 [12] ,X染色体失活 [13] 。
Sigma公司FITC标记的抗兔或抗鼠二抗,用于免疫组化和流式细胞术中,研究细胞基质金属蛋白酶7的功能 [14] ,LRRK2的亚细胞定位 [9] ,疱疹病毒1 ICP0的功能 [15] ,趋化因子在细胞归巢中的作用 [7] 。
VectorLabs 的FITC标记的抗大鼠的生物素二抗以1;200稀释,在免疫组化实验中证明新生儿心脏的再生能力 [16] 。
荧光素最流行的应用之一是细胞凋亡检测。能直接标记DNA片段的方法主要有两个,其一,利用带有荧光素标签的核苷酸( TUNEL分析)和用荧光素( 膜联蛋白亲和分析)结合膜联蛋白。另一个方法是通过荧光素标记的抑制物Z-VAD-FMK来检测 半胱天冬酶活性。
来自EMD Millipore公司(Millipore, Chemicon)的ApopTag荧光素原位杂交凋亡检测试剂盒 (链接)是最受欢迎的TUNEL分析系统。其在免疫显微技术和流式细胞术中用于研究果蝇Sir2在细胞存活和死亡中的作用 [17] 、非达司他 [18] 、心肌细胞色素P450 [19] 、A-T样疾病中DNA损伤和Nijmegen断裂综合征 [20] 以及IL-1受体 [21] 的作用。Rusty Kelley等人于2009年在TUNEL分析中使用Promega公司的荧光素-12-dUTP,用于研究Bmper的功能 [22] 。
膜联蛋白V(Annexin V)能与磷脂酰丝氨酸结合,这种情况在细胞死亡或者凋亡中会出现在细胞膜小叶外部。在显微镜下或者利用流式细胞术,荧光素标记的膜联蛋白能被用于检测并且定量凋亡/死亡细胞。EBiosciences (Bender MedSystem)的 膜联蛋白V FITC凋亡检测试剂盒被用于研究鼠血糖的控制 [23] 、人前列腺癌的起源 [24] 。AC liu 和AI Gotlieb在2008年使用R & D Systems的 TdT-荧光素原位杂交凋亡检测试剂盒,用于研究TGF-β在调节间质细胞损伤修复过程中的作用 [25] ;来自于BD Biosciences (Pharmingen, Transduction Laboratories) 公司的与荧光素结合的膜联蛋白V在流式细胞术和免疫显微技术中用于研究白细胞病因 [26] 、H5N1-编码的NS1 [27] 、组蛋白H4抑制子1R-Ch1 [28] 、雌激素受体与ErbB2通路 [29] 、RDP58 [30] 、runx3和T-box蛋白家族 [31] 、HPV癌蛋白E6 [32] 、脂肪酸合酶 [33] 的相互作用。Roche Applied Science原位杂交细胞死亡检测试剂盒被用于研究大肠杆菌志贺毒素1的作用 [34] 、Snai1条件突变胚胎 [35] 和梅林 [36] 的影响。YB Choi YB 和Nicholas J在2008年使用Biovision公司的FITC或者Cy-3结合的膜联蛋白V用于研究人类疱疹病毒8化学增活素在内皮存活和病毒复制中的影响 [37] 。PA Gillis、LH Okagaki和 SA Rice使用Sigma APOAF膜联蛋白V-FITC凋亡检测试剂盒用于研究单纯疱疹病毒1型ICP27对p38细胞分裂素活化蛋白激酶的影响 [38] 。
Promega 公司的FITC-VAD-FMK(半胱天冬酶抑制剂)在凋亡检测分析中用于研究microRNA155 [39] 和 ephrinB3 [40] 。
荧光素除了在TUNEL分析中会广泛运用到,荧光素标记的核苷酸还可以在细胞增殖( 溴化去氧尿苷 结合)、流式或者作为原位杂交的探针得到利用。Abbott Molecular 公司的FITC标记的人7号染色体着丝粒探针用于FISH实验,研究雌激素受体敲除细胞在前列腺癌治疗中的作用 [41] 、罗氏公司的荧光素可以标记X染色体失活的特异转录本RNA探针,用于研究X染色体失活 [13] 。
为了检测DNA合成和细胞增殖,BD Pharmingen公司FITC Brdu流式试剂用于流式细胞术,来研究c-Myc的功能 [42] 以及Ezh2在干细胞分化中的作用 [43] 。
RA Heimeier, VS Hsia, and YB Shi在2008年使用Applied Biosystems公司的6-羧基荧光素标记的Taqman探针用于定量PCR实验,来研究BRG1-结合因子57和BRG1-包含染色体重构复合物在基因激活中的作用。
同二抗一样,在流式细胞术和免疫荧光实验中,一抗也可以被荧光素标记。BD Biosciences (Pharmingen)公司的FITC标记的一抗用于CD4阳性细胞发育(抗-CD8) [44] 、Mac1阳性细胞渗入(抗-Gr1) [45] 、复合免疫酶染色法的发展(抗-CD3) [46] 以及移植物排斥(抗-CD4) [47] 的研究。在2009年,MJ Barnes等在流式细胞术中使用Southern Biotech CD4-FITC标记的抗体,用于T(Treg) 细胞谱系的研究 [48] 。在2008年,S Martín-Vilchez等在流式细胞术中使用FICT结合的CD80、 CD83和CD86抗体,用于人树突细胞成熟的研究 [49] 。
FITC可用于结合标记抗体,例如c-Myc、His和FLAG,以及其他用于染不同靶位的亲和性试剂。
在2011年,SJ Fleishman等在流式细胞术中使用Miltenyi Biotec 公司的FITC结合的c-Myc抗体,用于利用计算方法来解释流行性感冒治疗的研究 [50] 。在2009年,W Fang等人在免疫细胞化学实验中,使用Anaspec公司FITC结合的His标记抗体,用于产生杀死蚊子的转基因菌类的研究 [51] 。在2009年,CM Chan等人使用Sigma公司的FITC结合的Flag标记的一抗,用于MHC I分子(HLA-C)的研究 [2] ,在同一年,R Kanteti等人使用罗氏地高辛荧光素用于PAX5的研究 [52] 。
抗生物素蛋白-生物素亲和系统已经在许多地方中被应用到。生物素蛋白和生物素能与荧光素连接,以获得高保真度的检测结果。在2010年,K Inoue等人在FISH实验中,使用EMD Millipore (Calbiochem)公司的FITC标记的抗-生物素抗体,用于在核转移中非编码RNAX染色体失活特异转录本的研究 [53] 。Vector Labs的FITC标记的抗生物素蛋白在免疫组化实验中用于类肝素酶对细胞粘着和细胞扩散的影响 [54] 、鼠类睾丸成熟 [55] 和幼年兔小脑皮层发育 [37] 的研究,其公司的MOM荧光素试剂盒可用于免疫染色实验 [56] 。在2008年,YB Choi and J Nicholas使用罗氏FITC标记的抗-生物素用于研究人疱疹病毒8化学增活素对内皮存活和病毒复制的影响 [37] 。A Slipicevic等在流式细胞实验中使用Amersham公司的FITC标记抗生蛋白链菌素,用于脂肪酸结合蛋白7的研究 [57] 。
次毒蕈环肽(phalloidin)能与丝状肌动蛋白结合。在2008年,MA Horswill等使用Sigma-Aldrich公司的FITC标记的次毒蕈环肽用于细胞核的染色,来研究maspin启动子DNA甲基化和H3组蛋白去甲基化 [58] ;在2009年,T Joshi等人使用Life Technologies (Molecular Probes)FITC标记次毒蕈环肽,用于染色IFN-γ处理过的巨噬细胞,研究PI3k/Akt信号通路在巨噬细胞调节的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用 [59] 。
外源凝集素(lectin)是一类能与糖类相结合,并具有高度亲和性的蛋白。FITC标记的外源凝集素用于标记特殊的细胞。Vector Laboratories 的荧光素-外源凝集素用于检测小神经胶质细胞 [60] ,并且免疫细胞化学实验中使用这种FITC结合的伴刀豆凝集素a用于轴突突出部分的研究 [61] 。在2008年,J. Fan 等人使用Sigma公司的FITC结合的花生凝集素(PNA),用于转基因小鼠视网膜的研究 [4] ,RI Nurieva 等在2009年使用Biosciences (Pharmingen)公司的FITC标记的PNA,用于小囊辅助性T淋巴细胞发育的研究 [62] 。在2009年,A Lorts 等人在免疫组化中使用Sigma公司FITC标记的麦胚凝集素,用于骨膜炎的研究 [63] 。
荧光素也能与大分子相结合,用于检测细胞膜和组织结点的完整性。其中一个很典型的分子是葡聚糖。Sigma公司FITC标记的葡聚糖用于铜向外运输体ATP7A [64] 、角膜血管发生 [65] 、视网膜血管渗透性 [66] 、肺内皮细胞屏障作用 [67] 的研究。S Banerjee等人使用Molecular Probes 公司的FITC标记葡聚糖,用于果蝇分隔连接的研究 [68].
通过荧光素酪胺系统,能够使原位杂交和免疫组化的信号均得到增强。Perkin-Elmer公司的TSA荧光素酪胺试剂包被用于CD39 [69] 和Hippo信号 [70] 的研究。
FITC标记的大分子能用于跟踪微血管。Ewan A. Ross等人在2008年使用FITC标记的牛血清白蛋白,用于微血管的鉴定 [71] 。
荧光素的衍生物还有其他有趣的应用。5-6-羧基荧光素双乙酸琥珀酰亚胺酯作为pH指示剂,用于酸类的pH检测。Molecular Probes公司的5-6-羧基荧光素双乙酸琥珀酰亚胺酯用于金属蛋白酶-7 [14] 、细胞毒T淋巴细胞相关分子-4 [75] 的研究。为了监测活性氧簇的产生情况,Ho-Chou Tu等人在2009年使用流式细胞术,并利用2,7-二氯荧光素双乙酸盐 [76] ;在2008年,Tatyana N. Milovanova等人使用Kodak二氢-2,7-二氯荧光素 [77] 。
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