流式细胞术-纵览与基础
Tom Rowley (tjrowley3 at gmail dot com)
Columbia University, United States
译者
王秀英 (mary at labome dot com)
美国新泽西州普林斯顿合原研究有限责任公司 (Synatom Research)
DOI
http://dx.doi.org/10.13070/mm.cn.2.125
日期
更新 : 2015-03-22; 原始版 : 2012-08-09
引用
实验材料和方法 2012;2:125
英文摘要

This article reports a survey of flow cytometers cited in literature, and also introduces the basics for flow cytometry.

流式细胞术的文献引用

来邦网在204篇随机选取的采用流式细胞术的文献中针对该技术进行了调查。表一列出了文献中引用的所有的流式细胞仪供应商以及四台最常见的流式细胞仪型号。

供应商文献数型号文献数
BD Biosciences184
FACSCalibur66
LSR II53
FACSCanto26
FACScan25
Beckman Coulter17
Dako11
Miltenyi Biotec2
Guava System/EMD Millipore1
表一: 流式细胞仪供应商,常见流式细胞仪型号和来邦网调查报告中的对应被引用文献数
导言

流式细胞术常用于测量分析混合悬液中单个细胞或者其他生物颗粒的物理和化学性质。多数的细胞仪可以检测直径1~15微米的细胞。在特定条件下,也可以检测分析直径超出此范围的颗粒(0.2 -150 微米) [1] 。 流式细胞仪有很广泛的应用:绿色荧光蛋白表达的分析 [2, 3], 倍数性分析 [4, 5], 免疫表型分析 [6, 7], 肿瘤诊断 [8, 9], 细胞分选 [10, 11], 以及细胞计数 [12] 。 表2列举了流式细胞仪的常见应用方法。

研究领域常见应用相关文献
免疫表型癌症诊断/监控 [13-15]
监测艾滋病毒/艾滋病的进展 [16]
药物发现耐药性/药物吸收 [1, 8, 17]
DNA分析倍体分析 [4, 5]
染色体分析和分类 [4, 10, 11]
性别预选 [18]
体内的转基因产品GFP表达分析 [2, 3]
微生物学微生物鉴定 [1, 19, 20]
细菌存活 [21, 22]
表二: 常见流式细胞仪的应用

大量细胞形成液流与入射激光束相交从而激发产生荧光。流式细胞仪从而收集细胞液流被激发产生的荧光,进一步由专业软件分析获取的数据,从而得到细胞特性,如大小,内部复杂度,表型和健康度。流式细胞术的强大在于可以在较短的时间内分析大量细胞的多个性状。

流式细胞仪的原则

流式细胞仪有4个基本组成部分:细胞流动系统,光源,光学系统和电子/外部电脑系统(图 1)。此外细胞分选系统可以用于收集穿过激光光源的细胞。

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 图 1
图 1. 流式细胞仪的基本组成。

简单的来说,细胞悬液通过流式细胞仪的采集器在一定压力下进入流动室。 单细胞悬液被鞘流液包绕与单个或多个激光垂直相交(常用激光器),从而在穿越流动室的过程中细胞被激发而产生荧光。不同波长的散射光和荧光的组合数据被光电探测器记录(取决于该荧光物是否存在于细胞中)转换成电子信号(电压)。外接电脑从而数字化电压信号进一步推算出细胞的特性。

流动室

流动室是流式细胞仪的核心部件。细胞、微生物通过流动室与激光相交。样品悬液在流动室内的管口中心与激光相交,同时被激发的散射光和荧光被光学系统收集检测。流式细胞仪的流动驱动系统的设计促使细胞在鞘流液约束下成单行排列一次通过激光检测区。这个过程称为流体聚焦(图 2)。

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 图 2
图 2. 样品的流体聚焦。

样品被注射进入鞘流液的中心,其原理类似于层流。样品压强高于鞘流液的压强。而样品液流速度通过压力调节器调整样品/鞘流液压强比来调整。液流速度随着样品压强的增大而加快,同时样品中心更宽而更多细胞可以一次通过激光检测点。相反,降低样品压强可以减慢液流速度从而减少一次通过激光检测点的细胞数(图 3)。较宽的样品中心导致了一些细胞在穿越激光检测点的时候偏离中心从而与激光以非最优角度相交。一般情况下,液流速度快则分辨率低,多用于性状分析(如表型检测) [13, 15] 。 液流速度低从而多数细胞通过检测点的中心与激光相交则分辨率高,多用于对精密性要求大的检测(如脱氧核糖核酸的分析) [4, 23] 。

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 图 3
图 3. 液流速度通过样品压力来调节。
激光检测区

流体聚焦使微粒和细胞成单行排列通过激光检测区。当样品与激光相交,光被折射或者向各个方向散射。光的偏离程度取决于微粒的物理性质,尤其是内部复杂度和其大小。细胞的形态,表面形态,膜,核以及颗粒状物都影响光的散射。

光的散射从两个方面获取:前散射和侧向角散射。前散射是测量顺着激光光路或者前进的方向上的衍射光,与细胞表面大小或者细胞大小成比例。侧向角散射是从几乎与激光光路垂直的角度收集到的折射光和反射光,与细胞粒度或者内部复杂度成比例(图 4)。

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 图 4
图 4. 细胞的光散射特性。

前散射和侧向角散射数据用于区分样品的大小和内部复杂度。例如,图5说明了前散射和侧向角散射数据图如何显示了周边血样品细胞形态(每一个点代表了一个细胞)。 X轴方向代表了前散射,越小的淋巴细胞所代表的点出现在轴的越左方。侧向角散射(Y轴)用于区分大小相近却细胞粒度不同的单核细胞和中性粒细胞。流式细胞仪还可以检测标记细胞的荧光表达。结合前散射、侧向角散射和荧光表达数据使研究者能够从样品中梳理出许多细胞亚群。

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 图 5
图 5. 周边血样品的2维散点图。

氩离子激光器能够发出波长为488nm的光,可以激发多种荧光染料,是细胞仪最为常用的激光器。许多荧光染料可以由同一波长的光激发(如488nm),其峰值辐射波长亦可以区分,则可以组合使用。 2种最为广泛组合使用的荧光染料是异硫氰酸荧光(FITC)和藻红蛋白(PE)。 FITC和PE的吸收光谱峰值在495nm附近,同时可以由氩离子激光器的488 nm波长的激光激发(注意: PE在545nm有另一个最大吸收峰值)。FITC和PE的峰值辐射波长分别为530nm和570nm,因此他们的信号可以被不同的探测器识别区分。

荧光信号强说明细胞或颗粒上标记有该荧光物的分子多。当单抗和如FITC、PE等荧光染料结合,则可以用于识别表达特定表面蛋白的特异的细胞类型。因此,在一份混合多种细胞类型的样品中,不同的荧光染料可以用来区分不同的细胞亚群。结合前散射和侧向角散射的数据,各个亚群的荧光表达可以用来判定样品中存在的细胞亚群类型和数量。

双色和三色流式细胞术检测室最为常见的。随着硬件(激光器和光学部件)、荧光染料和分析软件的进一步开发,5色或者更多的检测也成为了可能。在多色流式细胞术的应用上,有3个注意点: 1) 荧光强度高的荧光染料更容易和单抗结合,与其他荧光染料的吸收光谱重叠也更少 [24] ; 2) 使用多个激光器激发不同的染料,以及选择性滤波器来降低探测器接收到的光谱重叠; 3)分析软件能够对不同染料之间由于光谱重叠导致的差异进行补偿;

光学系统

流式细胞仪的光学系统由二个部分组成:激发光学元件和接收光学元件。激发光学元件(激光器和透镜组) 聚焦和调整极光光线使其能一直以同一个角度在流动室激光检测区与样品相交。从样品颗粒发出的光线则由接收透镜组接收,穿过一组二色光学镜和滤光片(带通滤波、短传和长传,使特定波长的光被特定的光学探测器接收。这个过程由接收光学元件完成。

图 6 描述了激光激发颗粒或者细胞后的光路。前散射光由接收透镜接收后被光电二极管转换成电流信号而被电子系统记录。正如前文所述,这是前散射信号,与细胞大小成比例。和激光光路90度的方向的散射光也被收集,代表了侧向角散射光和被激发的荧光。射出的侧向角散射光和荧光由接收透镜接收后导向光电倍增管(PMTs)。光通过一系列分色镜和滤光片被光电倍增管接收。由于PMTs通常能够检测微弱的荧光信号,所以滤光片被放置于光电倍增管的前方使之能够最大程度的检测特定颜色的光线。 这些滤光片只允许一定波长的光穿过,同时与特定荧光染料的发射峰值相符。允许特定光谱带通过的滤光片称为带通滤波片。举例来说,位于FITC检测器之前的滤光片标记为530/30, 这表明只有波长为515 nm~545 nm的光可以通过。

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 图 6
图 6. 流式细胞仪的光学系统。

流式细胞仪中有2种滤光片。短传滤光片(SP) 使短于等于一定波长的光通过,长传滤光片(LP)则允许长于或等于一定波长的光通过(图 7)。

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 图 7
图 7. 流式细胞仪的三种滤光片: 带通,短传和长传。

流式细胞仪中的分光镜可以发射特定波长的光而使其他波长的光穿过镜片。和滤片类似,分色镜也可以分为短传或长传。例如,510LP分色镜可以允许波长大于等于510nm的光穿过镜片,同时反射波长小于510nm的光到滤光片或者另一个分色镜。

总体来说,激光器和激发光学元件的聚焦镜能够是光束在特定的汇聚点和颗粒或者细胞相交。由此产生的散射光被接收透镜接收,从而被导向光电二极管或者一系列分色镜或者滤光片(侧向角散射和发射荧光)而被合适的光电倍增管接收。光电管将这些光信号转换为电流,从而传递到电子系统。

电子系统

流式细胞仪的电子系统有两方面的功能:光电信号的转换和数据分析。光电信号的转换是由之前提到的2种光电探测器(二极管和光电倍增管)中的一个完成的。二极管对光相对不敏感,多用于检测较强信号的前散射。光电倍增管能够识别相对较弱的信号,因此多用于检测侧向角散射光和被激发的荧光。

当颗粒或者细胞和激光相交产生散射光或者激发荧光时,一个电子信号或者电压脉冲信号就产生了。产生的散射光或激发荧光然后进入光电探测器(PMT或光电二极管),转换成电子。电子信号叠加形成了电流。电流信号被放大转换成电压脉冲信号。电压脉冲信号随着细胞与激光相交而增大,当细胞进入光线中心时达到峰值,之后逐渐回到基值直到细胞穿过光线(图 8)。

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 图 8
图 8. 电压脉冲的生成。

最后,电压脉冲信号被信号处理器量化为脉冲高度、幅度和区域。这个数值数据再被传输存储到到细胞仪的电脑工作站以供进一步分析。

流式细胞术数据分析

流式细胞术的一个主要优势在于使得研究人员能够测量样品中每一个细胞的多个性状。当数据被数字化后,则可以通过细胞仪的电脑软件进行剖析。数据处理的深度多取决于研究人员的目的,可以仅仅根据前散射、偏向角散射进行简单的形态分类,也可以通过样品中不同细胞表面分子(荧光物)的表达情况区分出多个细胞亚群。流式细胞术数据的常用可视化方法将在之后讨论。

频率曲线和点状图

频率曲线是一幅单参量图,Y轴表示了细胞数量,X轴(对数或者线性)描述了该参量数字信号值。举例来说,图9是一幅对数频率曲线图,横轴表示FITC信号的强度,竖轴表示通道中的事件数量。

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 图 9
图 9. 单参数的对数直方图。

点状图是一幅样品性状的双参量图,图中的每一个点对应了一个细胞。图10所绘的是一幅典型的散布图(前散射vs偏向角散射),用于表示样品中的细胞大小和复杂度。

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 图 10
图 10. 双参数线性点状图。

荧光信号的强度范围决定了是用线性标尺还是对数标尺来描述该参量。当强度范围窄则使用线性标尺,因为在对数标尺下,细微的差异会被忽略。相反,当荧光强度差异范围达到百倍,使用线性标尺可能导致轴方向上的图过于压缩,则可能使两个不同的群体难以显现区分。

可以通过定义门来定义数据的子集。一个门是一个数字或图形化边界,用来隔离亚种群粒子/细胞,从而从样品中以有限数量的事件得到统计数据。

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 图 11
图 11. 周边血样品中单核细胞的门定义。

例如,研究人员通过分析荧光标记的周边血样品来识别CD4和CD14的表达,但他仅仅想知道单核细胞中这些表面蛋白分子的表达情况,他们则需要在FSC vs.SSC的散布图中对单核细胞定义一个门(图 11),从而将他们所看到的数据限制在单核细胞而不是样品中的所有细胞。接着,使用点状图来定义荧光表达区域,使他们可以清楚的知道单核细胞中只表达CD4的比例,只表达CD14的比例,都不表达或者双表达的百分比(图12)。

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 图 12
图 12. 定义门中单核细胞的表面蛋白分子的荧光表达数据(CD14和CD4)。
细胞分选

当颗粒、细胞穿过激光之后就被送去了废物抽吸器。荧光细胞分选是一个细胞经过流式细胞仪后被重新收集以供进一步分析的过程(如显微镜检查,细胞培养等)。为了分选细胞,目标群体必须先用门定义,从而细胞仪知道所要分选的对象。当分选对象被定义好,软件则能够在对应的细胞穿过激光时识别出来。带有传导性的鞘液流使得样品从喷嘴射出时可以震动分裂形成一定大小的液滴,每一个液滴包裹一个细胞。之后 电荷按分选门的设置条件被加载在这些包含细胞的液滴上。震动液流的两边分别为带正电荷或负电荷的电板。当带电液滴穿过这些带电板时,受到电荷作用液滴偏向不同的收集器(图13)。细胞分选能够分离纯化细胞亚群,其应用极大的扩展了流式细胞仪在研究以及诊断领域的应用。

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 图 13
图 13. 流式细胞仪的细胞分选硬件。
软件

流式细胞仪生产商提供使用机器所需的软件。这些软件多用于应用设置以及数据采集。例如,BD公司在他们的流式细胞仪里提供了BD FACSDiva软件。该软件简化了操作,自动化设置细胞仪。为用户提供了简明的试验界面,使之能方便的获取可重复数据。此外,FACSDiva软件能够让细胞仪用户在可视化界面上看到检测器、滤光片和透镜的设置,并在该界面上配置机器内的光学元件。生产商提供的软件同样也可以用于数据分析,但仅限于一些基础的功能。

当用户需要的分析无法由生产商提供的软件完成时,可使用全方位分析性软件。FlowJo 是一款市场上常用的用于分析流式数据的软件包。细胞仪读写数据格式为流式细胞仪标准格式(文件扩展名为.fcs)。如FlowJo这样的第三方软件可以读取这些格式的文件从而能够分析从任何一个品牌的流式细胞仪中输出的数据。

总结

流式细胞仪应用光散射原理以及荧光分子的激发和发射原理来收集0.2~150微米大小的颗粒或细胞的多方面参数数据。流式细胞仪的最大优势在于其速度。科学家可以在显微镜下用细胞计数仪以约每分钟250个细胞的速度进行计数。一台流式细胞仪可以以每秒上千个细胞的速度区分细胞。

样品在流动室中由于流体动力学原理形成一束单细胞、颗粒的悬液。在相交点,细胞穿过激光,形成光散射以及荧光激发。散射光被前散射方向以及侧向角散射(90度)方向上的收集透镜重新导向光学元件系统。分光镜系统以及滤光片改变特定波长光的光路,重新导向去对应的光电探测器(二极管和光电倍增管),从而信号被放大转换成电流信号。

电压脉冲信号之后被电脑系统进一步转换成数字信号。分析软件从而根据细胞的光散射特性进行分类。使用门或者包括直方图以及点状图在内的标图方式可以进一步区分亚群。分选仪器可以用来重新收集穿过激光的细胞以达到保留或者纯化样品的目的。 流式细胞术是一种昂贵但是却极佳的细胞分析手段。它最大的缺陷在于其经济承受力(其次是大小)。细胞仪是需要花费30,000美金(二手)到300,000美金(全新)的庞大机器,这其中还不包括鞘液、荧光标记物,更换元件、分析软件以及其他所需的使用装备的花费。许多研究院和医院的不同部门共同承担分享一系列机器,从而共同分担购买及使用细胞仪而产生的大额消费,并且使得研究所内和医院内部的多数研究人员能够使用细胞仪。

流式细胞术在不断的进步演化,从而其使用费用在降低。更新更低廉的二极管激光器取代了昂贵的气体离子激光器 [24] 。同时,一些应用流式细胞术原理却相对低廉的仪器也被开发。2011年,UCLA的一组研究人员设计开发了一台轻便简洁的细胞仪,这台细胞仪可以和手机相连,同时其使用花费不到10美金。除去高昂的花费以及对训练有素的操作者的需求,流式细胞术依旧是高速样品分析的最佳首选。

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