锌指核酸酶 (ZFN) 技术已经成为了在多种细胞类型和生物体内进行高效、位点特异性的基因修饰的一个常用工具(参考来邦网近期的一篇方法学文章 改造ZFN的一种新方法)。然而，用ZFN进行基因组编辑时构造包含有与基因组修饰位点同源的区域的供体质粒是很费时的。Sigma-Aldrich最近报道了一种利用单链DNA寡核苷酸与ZFN相结合的基因组编辑新方法 [1] 。

定点基因修饰对于研究基因功能和对遗传疾病的基因治疗是极其有用的。ZFN经改造包含有FokI内切酶的一个非特异性切割功能域和一个锌指DNA结合功能域。这个锌指功能域可以使ZFN在复杂的基因组中定位到特异的位点。利用内源性的DNA修复机制，ZFN技术已经成为了一种用于基因组编辑的强有力方法。

单个锌指功能域识别3-4个碱基对。通常一个ZFN含有3-6个锌指，能识别9-18个碱基对。由于FokI是以二聚体的形式作用的，因此需要两个ZFN分别结合在想要切割位点的上游和下游。这样的工作模式可以保证高的特异性。在由锌指功能域所确定的位点，FokI内切酶的切割功能域会引入双链断裂。这些双链断裂通过非同源性末端接合和同源指导修复被修复。非同源性末端接合可用于删除编码区域或调控序列，同源指导修复可用于进行突变和插入转基因。

然而，ZFN技术通常需要包含有与要修饰位点两侧有200-800个同源碱基对的供体质粒。虽然这些质粒比传统的基因打靶载体要小得多，却仍要几周的时间来构建它们。因此，最近由Sigma-Aldrich报道的用单链DNA寡核苷酸来替代供体质粒的方法可以极大地促进基于ZFN的基因靶向研究。

长度为100-30个碱基对的单链DNA寡核苷酸被用于确定最小的同源性要求。碱基对从40减至30个时发现效率会有所下降。利用含有一个ZFN切割位点的AAVS1位点作为模式体系，发现当单链DNA寡核苷酸所靶向的位点离切割位点较远时（例如相距0.1-1Kb），无法检测到HindIII位点的插入。作为演示，一个密码子突变被引入到 RPS6KA3基因中，其编码的激酶RSK2被认为在智力迟钝、心理运动、骨骼疾病和癌症中都发挥作用。此外，还引入了一个将胞嘧啶突变成腺嘌呤的沉默突变，从而产生一个BamHI的限制性位点，这样能便于用基于限制性片段长度多态性（RFLP）的检测方法来检测想要的克隆。加入阻断ZFN的沉默突变被推荐用于防止在基因转变后ZFN的额外切割。将设计好的单链DNA寡核苷酸和编码ZFN的mRNA转染进K562细胞后，RFLP测试检测到的BamHI位点转变率为22-32%，而单细胞克隆可以从～750个克隆中得到至少20个同时包含BamHI转变和想要的C436V转变的克隆。另外还测试了利用ZFN技术进行缺失操作。由于仅一对ZFN只能产生<50bp的缺失，因此需要两对ZFN来产生更大的缺失。

利用ZFN技术产生出了0.1-100 Kb的缺失，而含有所需缺失的克隆则利用一个结合在缺失区域内的引物和另一个结合在缺失区域外的引物通过 PCR筛选出来。PCR结果显示在K562细胞内，AAVS1位点中1Kb、5Kb和10Kb的缺失率分别为2.9%、0.6%和0.2%。这些PCR结果也通过DNA印迹加以确认。100bp和500bp这样小一些的缺失能产生高得多的缺失率，可以分别达到21%和10.8%。此外，通过该ZFN技术可以实现在大片段缺失的同时插入一个loxP重组酶位点。

利用单链DNA寡核苷酸的ZFN技术与使用双链寡核苷酸或质粒供体的技术相比有几大优势。据报道，利用单链DNA寡核苷酸进行修饰的产率是使用质粒供体所得到产率的两倍。在双链断裂处单链DNA寡核苷酸所产生的非忠实性整合也较少。由于现在要合成单链DNA寡核苷酸是件很简单的事，这些技术可以为科学家提供更多的自由度来进行复杂的基因组编辑。

然而并不是所有的基因组修饰都能用这一ZFN技术实现。在报道中，在AAVS1的ZFN切割位点的5'和3'方向都有缺失的100bp缺失就没有得到 [1] 。因此，这一技术可能还需要进一步的改进。但很明显，该ZFN技术可以极大地方便基因组编辑。