免责声明：这篇文章不是医疗指导，任何人怀疑/已接触过性病/性传染病，应咨询持有资格证的医疗专业人员。本文是为有兴趣了解性病的读者介绍临床诊断方法。

根据 世界卫生组织（WHO）统计，通过人类性行为传播的病原微生物每年新感染超过4亿人。用来消灭这些病原体的治疗方法必须针对特定入侵者，识别对疾病诊断起决定性作用的特定病原体并给予适当的治疗。由于多种病原体可引起类似的症状，识别致病的病原体通常不能光靠咨询医生。严格的微观和分子生物学方法已被用于临床微生物学来定期准确地识别在人体血液、血清、尿液和唾液中的病原体。本文介绍了最常用的临床微生物学检验方法，着眼于最广泛的病原体。本文仅作为一个指南，读者在进行检测前应了解国家和地方测试标准。

优化的治疗方案需要鉴定致感病原体。但是，这不是临床微生物学家费尽心机进行病原鉴定的唯一原因。追踪病原体的活动对保持人口健康是至关重要的，流行病学家还借助来自临床实验室和医院的报告来确定潜在的流行病。此外，鉴别人体标本中病原体的存在对管理捐献的血液和血清非常重要。

临床微生物学检验方法必须平衡敏感性，特异性，成本和所需的时间。

敏感性: 当病原体数值低时鉴别存在固有的困难，这使敏感性成为临床试验要考虑的问题。许多测试方法都需要活的微生物，从而致使在诊所收集以及随后运送至实验室的过程中对其的照料要求极高。因此，病原体的丰度和生活力，在考虑诊断测试的灵敏度时是必须考虑的。

特异性: 用于鉴定的方法通常被设计用以提供最大的特异性，从而病原体不会被错误地认定为存在或缺失。测试必须能够区分在正常菌群中的致病菌，因此，测试的特异性对于有效诊断是必要的。

成本和时间:其他考虑因素包括预算的限制，以及及时完成测试并通知主治医生。

性传播病原体微生物包括多种病毒、细菌和单细胞真核寄生虫。细菌和寄生虫通常不需要在人类宿主细胞内复制，但病毒是必须的，因为它们的基因组不包含完整的核酸复制和基因转录编码。虽然这些微生物体所造成的疾病类型是不同的，治疗方法也是不同的，但很多鉴定方法是相通的。细菌和寄生虫总是存在DNA基因组，而病毒可能会有RNA或DNA基因组。表1 总结了常见的性传播病原体。

沙眼衣原体沙眼衣原体是一种革兰氏阴性细菌，它须在真核细胞内复制，因此它具有专性细胞内的生活方式。 沙眼衣原体（C. trachomatis） 引起的非淋菌性尿道炎是 美国最常见的性传播细菌感染疾病。根据它的主要外膜蛋白（MOMP）沙眼衣原体通常被归为血清型。沙眼衣原体（C. trachomatis） 可通过酶免疫测定法（EIA）靶向MOMP，核酸（NA）识别法，或选择性培养来鉴定。 NA识别方法是最敏感的，而且比较基因组学的最新研究成果已质疑使用MOMP进行诊断的可靠性 [1] 。

淋病奈瑟氏菌淋病奈瑟氏菌是一种革兰氏阴性细菌，它能引起淋病，另被称为“The Clap”。 淋病奈瑟菌（N. gonorrhoeae） 可以被有选择地在德尔 - 马丁琼脂（Thayer-Martin agar）上培养，该琼脂包含各种抗生素从而可以抑制其他微生物的生长。广泛使用的基于NA扩增的分析法可以一并检测沙眼衣原体（C. trachomatis） 和 淋病奈瑟菌（N. gonorrhoeae） （详见图4）。

梅毒螺旋体是一种革兰氏阴性螺旋菌，它可以引起梅毒病。 梅毒螺旋体（Trep. pallidum） 可以通过使用迪特勒显微镜染色（Dieterle microscopy stain）来识别 [2] ，或NA扩增方法以外的任一种多血清学测试。

阴道毛滴虫 阴道毛滴虫是一种能动的原生寄生虫，它能引起滴虫性阴道炎。最常见的检测方法是显微镜检验和培养，两种方法都需用InPouch TV培养基。

乙型肝炎（Hepatitis B）是一种DNA病毒，它可通过体液传播并导致肝炎。 乙型肝炎病毒往往通过其抗原，或响应病毒抗原所产生的抗体来检测 [3] 。与上述非病毒病原体一样，NA扩增法对乙型肝炎病毒的检测变得越来越普遍 [4] 。

单纯疱疹病毒 (HSV) 是一种DNA病毒，导致生殖器或口腔等地区皮肤损伤。该病毒可用Tzanck涂片镜检 [5] ，直接荧光抗体，或通过用PCR特异性引物扩增NA 来检测 [6] 。 由于无法区分抗HSV-1（主要是口腔）或HSV-2（主要是生殖器）所产生的抗体，单纯疱疹病毒抗体的测试通常受到阻碍；不过，基于对糖蛋白G的抗体的免疫测定是很有前途的 [7] 。

人类乳头状瘤病毒 (HPV) 是一种DNA病毒，可导致女性的宫颈癌和男女的生殖器疣。人乳头状瘤病毒的检测主要取决于症状本身：靠近子宫颈的异常细胞或生殖器附近的疣结构。虽然有几种以NA为基础的测试已被发明 [8] ，但它们尚未被广泛应用。

这些年来，人类免疫缺陷病毒（HIV）已经受到了很多的关注，这是当之无愧的，因为艾滋病毒可以致使免疫系统破坏，导致个体无法对抗感染及制止癌细胞的生长。艾滋病毒是一种RNA病毒，附着在并感染免疫细胞，最终导致这些细胞的死亡。测试艾滋病病毒通常依赖于酶联免疫吸附试验（ELISAs），虽然NA扩增试验已被开发，但它们没有被广泛使用。

诊断方法用来检测有机体形态（通过显微镜），代谢（通过选择性培养），细胞大分子（通过免疫测定法），和核酸序列特异性（通过扩增和/或杂交）。这些测试还可以被结合起来，例如，同时使用荧光NA探头和显微镜（图1）。通常情况下，最重要的是要区分入侵者和泌尿生殖道中正常的微生物群。因为需要用多种检测方法来测试活微生物，所以临床标本的运输应该是经过精心策划的。表2 总结了常用的诊断方法。

显微镜是用于鉴别的最古老方法之一。受过训练的人能够区分出正常菌群中的病原体，但这取决

于病原体的密度是否高到足以在视野中检测到。显微镜检对有特征形貌的病原体，如螺旋形态的梅毒螺旋体Trep. pallidum，或运动和尺寸相对较大的阴道毛滴虫Trich. vaginalis非常有效。

多种不同的显微镜检方法可用于最佳识别。革兰氏染色和相位对比显微镜可以对微生物鉴定提供额外的信息。

临床微生物学家基于探测特定可疑的病原体分子来进行检测。例如，用荧光标记特异性抗体或NA探针润洗显微镜载玻片，用荧光来标记病原体以便容易识别。被染色的病原体可以在显微镜下被容易地观察到。用于抗体或其他部分的染色剂有很多种。下面是一个典型的过程。

直接荧光抗体技术（图1）

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图 1. 直接荧光抗体检测在人体样本中的细菌

1. 获得人体标本，缀合荧光抗体。
2. 将固定样品在显微镜载玻片上。在固定之前，可能需要解离样品，以便用移液管移液。
3. 以空气晾干，甲醛，或其他方法在载玻片上固定样品。带有小井的显微镜载玻片是最理想的，因为一个小等分的人体标本可以被放置在井中。
4. 添加抗体溶液到样品中，温育在指定的温度和湿度下。
5. 彻底清洗载玻片来除去任何过量的抗体，减少抗体浓度能够增加背景荧光。
6. 在常规荧光或共聚焦显微镜下观察。

病原体培养是另一种古老的方法，它仍然被认为是少数病原体的黄金测试标准。用于病原体鉴定的培养有赖于一种区分病原体和背景正常菌群的方法。如果简单地在培养皿中放上营养丰富的培养基，多种微生物都能够成长。要能做到只选择那些感兴趣的微生物，就需要选择性培养法，微生物学家现在可以利用微生物独特的代谢特性或抵抗性来将其实现。例如，滴虫病Trich. vaginalis 的黄金标准测试就是以InPouch TV的方法，用一个具双厌氧室的培养皿，进行镜检并以含有合适营养物质和抗生素的（专有）介质培养阴道毛滴虫。

选择性培养的注意事项包括：所需的营养成分，抗生素的选择，样品的分离以及划线工具（拭子，接种环等）。

选择性培养有用的细菌病原体（图2）

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图 2. 在人体样本中选择性培养细菌

1. 确定适当的选择性培养基。通常，这些培养基提供细菌本身不能合成的营养物质，为其独特的代谢过程提供基质，和/或对细菌有抗性的抗生素。添加这些抗生素重要的目的是要抑制正常菌群的生长。
2. 依据一个设计好的指导方法将临床样本播种在非选择性和选择性培养基上。注意人体样品中的细胞数可能很高，并且有可能是一个“芒”增长。有必要时可在琼脂培养基上将人体标本稀释1-10倍。
3. 孵育被接种的培养皿。此步骤是成功的关键，孵化温度，湿度，氧浓度，和持续时间都对微生物的生长具有重要的影响。
4. 在适当的孵化阶段后观察细菌的生长。如果生长了，有时进行一个后续验证实验是必需的。例如，可再次在相同的选择性培养基上划线接种以确认菌落的生长。 其他有关NA杂交或放大的测试也是可行的。

培养病毒是可能的，但更复杂，因为需要有人体细胞供病毒繁殖 [9] 。

免疫测定法已被广泛用于很多性病病原体的识别，并且它仍然是艾滋病毒检测的黄金标准。在这些测试中，为了寻找能证明病原体存在的分子，临床微生物学家可以测量病原体特异性抗原，和/或通过测量抗原对抗体的特异性来找寻免疫系统对病原体识别的迹象。大多数情况下，这些免疫

测定法通过诱导人体样品中可能存在的抗原及其特异性抗体来进行。抗体与抗原的结合可以通过荧光或一种酶反应来检测。

对于艾滋病毒感染的检测，临床微生物学可用ELISA方法来测试，它使用纯化的HIV病毒抗原作为“诱饵”来测试 人体血液中的艾滋病毒抗体 [10] 。 该测验的改进处，包括使用重组HIV抗原，使其具有极高准确性和安全性。然而， HIV感染和产生抗体之间的时间可以是几个星期，因此应用合并抗体夹心ELISA方法测定HIV的抗原和抗体，可使鉴定测试大幅改进。 酶联免疫吸附试验（ELISA）检测HIV抗原和抗体（图3）

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图 3. ELISA 检测人体样本中的HIV

商业化试剂盒可以高效和以高吞吐量的方式执行这些测试，并且除了对血液的检测，它对尿液或唾液样品中的抗体或抗原也是足够敏感的。高吞吐量性质的试剂盒，有助于降低筛选捐献血液的成本，并且敏感性的增加，有利于增进在发展中国家进行的测试，从而改善全球人类健康。

1. 获取用于测试的样品和市售的试剂盒;几种试剂盒在图3中列出。严格遵循试剂盒说明书。图3给出了一个ELISA过程的概述，虽然列出的每个试剂盒都能检测抗原和抗体，但它们对HIV的检测可能在具体的方法或反应物上有所不同。
2. 将单克隆抗体放到p24上，p24是艾滋病毒的衣壳蛋白,它们被固定在固体表面上。同时固定不动的还有一个联合抗原，其包含代表HIV-1和HIV-2株重组的抗原。测试设备中还包含未结合带有标记的抗p24多克隆抗体，和未结合的带标记的抗原。
3. 添加血液样品的等分试样（通常稀释后）到测试设备。如果HIV抗原存在，它将与抗p24抗体结合。同样，如果存在HIV抗体，它们将结合标记的抗原。从测试设备中清洗掉多余的带标签的抗体和抗原，然后通过它们各自的标签来量化抗原/抗体复合物。

以NA测序为基础的方法可被认为是最敏感的，它能检测到DNA或RNA分子，并且能够仅用尿液样本来检测，而不是从其他更具侵害性的方法（例如，宫颈或尿道拭子）来获取病原体。NA方法可以有很高的特异性，它能区分病原体和正常菌群，甚至是在不同的血清型之间，这为我们提供了重要的流行病学资料以及诊断数据。虽然存在有病原体DNA，但这并不一定表示有活病原体存在，因此许多以NA为基础的诊断测试依赖于核糖体RNA，由于它们比DNA的拷贝数要高得多，从而灵敏度可得到提高。 NA测试已成为例行方法，经过技术改进它们的成本被压低，它们很容易成为所有的诊断测试黄金标准。在未来几年内，随着技术变得不再昂贵，NA全基因组测序将会变得更加有用 [11].

NA方法有赖于杂交和/或扩增。杂交方法是用序列已知带有荧光标记的NA探针在样品中杂交其他任何互补的NA，并通常使用荧光显微镜来检测。扩增的方法是用小NA引物和PCR来选择性放大一个在分类学上带有标记的基因。扩增本身可获得一个积极的结论，或随后的扩增测序可以提供额外的信息。特异性杂交和扩增方法的关键在于荧光标记探针或引物，这些DNA片段的序列应该只和我们要研究的生物体相匹配与结合。

沙眼衣原体和淋病奈瑟氏球菌的核酸探针（图4）

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图 4. 核酸检测（NA）人体样本中的细菌

使用商品试剂盒来自测定这两种病原体的核酸是可能的，比如APTIMA 组合 2 （AC 2）化验。尽管确切的方法和所用试剂是专有的，图4中所示的步骤，提供了该试剂盒的应用概述。

1. 获得人类样本进行检测。在此示例中，溶解所有存在的细胞以便得到核糖体RNA。
2. 释放的rRNA基因现在可以结合到涂有特定序列的衣原体或奈瑟氏球菌珠粒上，因为只有这两种细菌的rRNA能够被结合到珠粒上。然后将这些珠粒的细胞溶胞产物从混合物中移走，包括它们上面所结合的rRNA基因。
3. rRNA现在作为反转录反应的模板，通过其合成互补DNA。然后，用该DNA作为模板进行转录介导扩增（TMA）。 TMA能够制造数千个标签序列，从而增加测试的灵敏度。
4. 当TMA完成后，在rRNA中加入已标记的互补DNA。带有标记的DNA和rRNA杂交体形成，它可被结合在上面的带有标记的DNA来检测和定量。

带引物的 聚合酶链反应 也常用于病原体的检测。尽管进行PCR反应所需的成本和时间通常会阻碍其在临床微生物学实验室中的推广，但随着技术的进步，很快PCR会变得更加便宜和快捷。

在用抗生素治疗被细菌感染的患者前，需要了解这些特定细菌病原体的抗药性。要获得此信息，临床微生物家通常将病原体在不同浓度的抗生素中进行培养，以确定其最低抑菌浓度（MIC）。由于细菌可很快产生对抗生素的耐药性，并且在同一种细菌的不同菌株之间都能表现出很大不同，所以即使是鉴定同一种菌，在做MIC测试时保持隔离是很重要的。

使用肉汤稀释法进行MIC（图5）

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图 5. 肉汤稀释法测定抗生素最低抑菌浓度

关于肉汤稀释法的具体指导，建议读者参考如 [12] 。

1. 确定一个丰富的培养基可供感兴趣的细菌生长。 将4或5个培养皿中的新鲜菌落接种到几毫升培养基中并在适当的孵化环境（如温度，通风）中过夜培养。使用多个菌落可减小自发突变对抗生素耐药性带来的影响。
2. 过夜培养后，以不同浓度的抗生素制备一系列稀释的加富培养基。这个过程可在试管中，或在一个有更高吞吐量的96孔板中进行。通常情况下，最好是连续稀释2倍（图5）。两管（或井）应保持无抗生素，一个将作为 “无抗生素”对照，以确保细菌能在培养基和温育条件下生长良好，而另一个将作为“无细菌”对照，确保介质没被污染。
3. 一旦这一系列抗生素稀释剂准备就绪，最终在密度为5×10 5菌落形成单位(cfu)/mL（除了 “无细菌”对照组）中接种细菌。细菌值可以通过用分光光度计读取培养物的光密度（OD值）而量化。 OD值和cfu / ml的细胞计数相关联，研究人员应该已经确定了用于达到所需接种密度的最佳OD值。
   对于“无抗生素”对照组，放一点在琼脂板上以形成足以生成细菌群落的体积单位。重要的是要确保细菌没有接种在过高或过低的密度中。将琼脂板和试管（或96 - 孔板）放置在适当的培养环境中。
4. 过夜培养后，将琼脂板上的菌落计数并检查试管或小井中细菌的增长，以确定最小抑制浓度（MIC）。 MIC是细菌增长不可见的最低抗生素浓度。更多详细信息，请参阅图5。

类似用抗生素治疗细菌感染，病毒感染的治疗往往与抗病毒药物有关。由于病毒利用人类细胞复制，选择不妨碍人类细胞正常代谢过程的抗病毒药物，可能是困难的。此外，由于病毒的基因组，特别是RNA基因组具有高突变率，它们可以迅速地进化而变得耐受抗病毒药物。以HIV为例，患者通常接受联合抗病毒药物的治疗;这些混合体通常包含至少三种药物，以用来针对艾滋病毒生活周期的两个不同阶段。由于病毒不太可能自发演化产生对多种针对不同阶段的药物的耐药性，所以使用联合抗病毒药物治疗能相对延长艾滋病患者的生命 [13, 14] 。

用于性病病原体的诊断方法是不断变化的，因为随着新技术的开发或优化，我们便可以更加快速、经济地得到更敏感和具体的结果。诊断方法从显微镜检、培养到以检测病原体蛋白质或NA为基础的方法而逐步递进。

有意测试这些病原体的研究人员要注意政府机构可能已有它的一套准则和优选方法，因此，这篇文章中所描述的方法只能用作对后续方案的开发和批准的指导。建议研究人员联系当地传染病组织来获取更多的指导。