利用同重标记已经实现了基于质谱的多重蛋白质组学定量。然而，由于蛋白质定量干扰所导致的比例失真却是十分普遍的。最近，Lily Ting等人发现三级质谱（MS3)几乎能完全消除这种干扰 [1] 。

质谱已经被广泛用于蛋白质组学。之前由于无法进行平行多重定量实验，限制了这一技术的产量。之后，同重标记策略如iTRAQ技术和串联质谱标签（TMTs)很好地解决了这一问题。据报道，利用稳定的同位素标记试剂，在多达八个样品中的相对蛋白浓度在一次实验中就能被确定 [2] 。在全扫描质谱中无法区分的肽段离子可以在串联质谱（MS2)实验中进行分离和分析后，根据具有较小质荷比（m/z）的碎片报告离子来进行定量。然而，污染性的近同重离子已经被指出会使这种实验中的定量数据不精确。这种干扰效应会导致对表达差异的低估。

为了评价并消除这种干扰效应，Ting等人建立了一个双蛋白质组的模式体系。芽殖酵母细胞的Lys-C蛋白消化物分别用六种不同的TMT试剂进行标记。进行串联质谱时，这六种不同的TMT试剂会在m/z为126、127、128、129、130和131的位置产生报告离子。不同标记的酵母多肽被混合在一起，使得报告离子在通道126比127和通道131比130的比值为2.5：1；通道127比128和通道130比129的比值为4：1；通道126比128和通道131比129的比值为10：1。类似地，HeLa细胞的Lys-C蛋白消化物用能够在m/z为126、127和128处产生报告离子的TMT试剂进行标记。等量（1：1：1）的不同标记的人源多肽混合在一起。然后将该混合物加到酵母多肽中，使得在通道126、127和128中的人源多肽总量为同样通道中酵母多肽总量的两倍。对于每个酵母肽段离子，在没有干扰效应的情况下，通道126比127、127比128和126比128的比值应该分别和通道131比130、130比129和131比129的比值相同。然而，由于人源肽段离子的干扰，通道126、127和128所测得的比值要小于通道129、130和131 的比值。比例失真的程度反映了人源肽段的干扰程度。

在Ting等人的实验中评价了四种可能可以消除或降低干扰效应的分析策略：（i）根据全扫描质谱的数据估计干扰程度，（ii）样品分级，（iii）降低母离子的分离宽度和（iv）获得MS3数据。在每个全扫描质谱中，干扰可以通过检测可见的干扰峰来测量。Ting等人将母离子分离窗口中目标离子强度在总离子强度中所占的相对比例定义为分离特异性。比较分离特异性<0.8的肽段离子的报告离子比值中间值和分离特异性>0.9的肽段离子的报告离子比值中间值时,预期比值为10的比例从1.9增加到了3.0，预期比值为4的比例从1.4增加到了1.8，预期比值为2.5的比例从1.3增加到了1.6。对具有高分离特异性的肽段离子而言，干扰只有些许的降低。这并不足以消除干扰问题。在样品分级策略中，全细胞裂解物的消化样品被分成20个强阳离子交换色谱组份。分级后，对于预期为10、4和2.5的比例，其比值中间值分别从2.7变为3.1、从2.0变为1.9以及从1.3变为1.6。同样也评价了将母离子分离宽度从m/z为2缩小到m/z为0.5的影响。对于预期为10、4和2.5的比例，来自于一个强阳离子交换色谱组份的酵母肽段的比值中间值分别从2.5增加到3.8、从1.7增加到2.2以及从1.5增加到1.7。此外，母离子宽度的降低导致了非重复肽段的确定数减少了22%。在MS3方法中，利用线性离子阱先选择一个在全扫描Orbitrap质谱中确定的目标离子进行碰撞诱导解离-MS2实验。最强的MS2片段离子再被选择出来进行高能碰撞（HCD)-MS3分析，从而产生定量数据。分成20个强阳离子交换色谱组份的双蛋白质组样品进行的MS3分析结果显示，有人源肽段干扰和没有人源肽段干扰的酵母肽段的比例中间值为分别为10.5和11.7（预期比值为10）以及4.4和4.7（预期比值为4）。数据表明MS3方法几乎完全消除了干扰效应并改善了精确性和准确度。然而，由于使用MS3方法时每个肽段离子需要产生两张图谱，与HCD-MS2方法相比，可定量的蛋白数目减少了12%。

总的来说，MS3方法可用于去除干扰相应并从而解决比例失真的问题。虽然在MS3方法中确定的肽段和蛋白较少，定量数据质量的改善弥补了分析深度上的损失。期待其它的方法和仪器的发展能改善MS3方法的灵敏度。