基因启动子中DNA CpG二核苷酸的 胞嘧啶甲基化是一种重要的表观遗传修饰。这种修饰可以调控基因的转录。然而现在很少有方法能以单CpG的分辨率用于大规模表征甲基化位点。最近，H. Kiyomi Komori等人报道了一种将亚硫酸氢钠处理后进行微滴PCR与下一代测序技术相结合的方法，为这一问题提供了另一种解决方法 [1] 。

DNA甲基化是一种众所周知的、用于对基因表达进行表观遗传调控的机制。在癌症中，原癌基因和肿瘤抑制基因的失调已经被发现与甲基化状态的变化有关联。甲基化也被认为在胚胎发育过程中参与基因表达的调控。在许多慢性疾病如自身免疫、炎症和代谢紊乱中都观察到了异常的DNA甲基化模式。

高通量测序的出现可以允许通过诸如甲基化DNA免疫沉淀（MeDIP)，甲基化CpG岛恢复试验（MIRA)和甲基化敏感性限制酶测序（MRE-seq)的技术对DNA甲基化位点进行更好的表征。MeDIP需要用一个抗 甲基胞嘧啶抗体对甲基化的DNA片断进行全基因组的免疫沉淀来富集甲基化位点。它不能提供单CpG的分辨率。MIRA与MeDIP类似，使用甲基结合蛋白来捕获甲基化的DNA。MIRA并不像MeDIP那样需要DNA变性，并且MIRA在具有低CpG密度的区域更加有用。MRE-seq能提供单CpG的分辨率。然而，这三种方法中没有一种可以用于大规模的定向分析。

亚硫酸氢钠转化是一种将未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶的化学修饰，它一直是甲基化分析的金标准。然而，之前深度测序的高成本和生物信息学上的挑战一直妨碍着它在对甲基化位点进行大规模表征方面的应用。Komori等人使用商用的 QIAGEN EpiTect试剂盒来对基因组DNA进行亚硫酸氢钠转化。然后他们使用了由 RainDance Technologies开发的微滴PCR扩增体系。这一扩增体系可以允许在不到一个小时内且在单个反应中进行1.5×10⁶个平行微滴扩增，并且能显著减少PCR扩增的偏好性。在设计引物时，每条引物上的CpG数量被限制在不超过一个。考虑到对于那些覆盖有CpG的引物而言存在有一个甲基化或未甲基化的胞嘧啶，在那些位点会使用兼并碱基（C/T或G/A，取决于哪条链）。为了使兼并性所导致的扩增偏好性最小化，CpG被确保处在引物最接近3'端的5个碱基之外。

为了测试该方法用于研究甲基化状态的能力，根据静息状态中和48-h活化后人原代CD4 T细胞中基因表达量的变化，选取了包含50个的一组基因。感兴趣的区域被确定为转录起始位点上游1 kb至下游1 kb处。野生型的Jurkat DNA和转甲基酶处理过的Jurkat DNA（高度甲基化）被亚硫酸氢钠转化并进行微滴PCR。产生的PCR文库被剪切成～200 bp，然后与测序接头连接。测序后， Novoalign的映射程序被用来将亚硫酸氢钠转化的DNA映射到参考基因组。就如预期的一样，结果显示在高度甲基化的样品中每个CpG都被发现是甲基化的。在野生型样品中，启动子中的CpG往往是完全甲基化或是完全未甲基化的。只有一小部分显示出了部分甲基化，这可能表明了细胞群中存在的差异性或可能是等位基因特异性的甲基化。在设计引物时，有些引物会产生部分重叠的扩增子。在这种情形下，正义链和反义链上CpG的甲基化状态都可以被确定。甲基化被发现是高度对称的。此外，启动子的甲基化状态也同Jurkat细胞中由RNA-seq确定的基因表达量进行了关联。具有甲基化CpG岛的基因显示出了较低的表达量或没有表达，而含有未甲基化CpG岛的基因其表达量的范围很广。为了进一步确认该方法的有效性，Komori等人将含有50个基因的文库增加至靶向～2100个基因并得到了类似的结果。

将微滴PCR与亚硫酸氢钠测序相结合可以对基因组中定向区域的甲基化状态进行大规模分析。该方法的主要缺点是仍然需要2 ug亚硫酸氢钠转化的DNA。进一步的研究将集中于优化微滴PCR的操作流程，以适应更少量的起始样品。