- Mary Johnson Ph. D.mary at labome dot comSynatom Research, Princeton, New Jersey, United States
- 王秀英博士mary at labome dot com美国新泽西州普林斯顿合原研究有限责任公司 (Synatom Research)
聚合酶链式反应(PCR)是分子生物学中的一项基本技术。1983年一位分子生物学家以一种不同寻常的方式首次构思出了这一技术,当时他正驱车行驶于加利福尼亚的高速公路上。这些年来,PCR对克隆技术有着直接的影响,而克隆技术对生命系统中基因功能的研究极为重要。克隆任意一段DNA包含以下四个基本步骤:分离目标DNA和载体DNA;使用限制性内切酶对目标和载体DNA进行切割产生可以相互连接的末端;通过切割末端连接目标和载体DNA;最后使用连接产物转化细菌等宿主细胞。
PCR克隆包括多种不同的方法:TA克隆,不依赖连接的克隆(LIC),重组酶依赖的克隆和PCR介导的克隆。那到底哪种克隆方法更为合适呢?任何一种PCR克隆的实用性主要取决于它的可靠性和简单性,而不是其他诸如方便,价格和最适条件下的有效性等因素。此外,最易于进行监测和优化的方法是最可靠的。举例来说,TA克隆和LIC都需要末端修饰,而末端修饰是无法进行监测的。
在所有的PCR介导的克隆方式中,重叠延伸PCR克隆是制备重组质粒的一种简单有效的方法,这一方法是由埃默里大学(美国乔治亚州亚特兰大市)生物化学系的Bryksin 和Matsumura最先引入。那如何应用这一方法呢?首先,使用合适的正反向引物对DNA插入片段进行PCR克隆得到最终的PCR产物,产物两端的序列与载体重叠。然后将载体和片段混合。变性退火之后,插入片段与载体杂交并在Phusion DNA聚合酶的驱动下延伸---这种聚合酶一个重要的特点是在使用载体作为模板时没有链置换活性。几轮PCR循环后,得到的产物是带有两个缺口的融合质粒(每条链一个)。然后使用这种新质粒转化大肠杆菌感受态细胞,转化后大肠杆菌细胞中的DNA修复酶可以封住缺口。
研究者首先使用绿色荧光蛋白(gfp)对这一方法进行了检测。使用特定的引物对gfp进行PCR扩增得到两端与pQE30质粒序列重叠的PCR产物。使用限制性内切酶DpnI 去除PCR产物中的母版质粒后转化大肠杆菌。研究者为重叠延伸PCR检测了五种不同的DNA聚合酶,发现Phusion DNA聚合酶最为有效,这可能是因为Phusion DNA聚合酶具有高持续合成能力和高保真性。其他研究者使用Taq DNA聚合酶开发出一种类似的方法,号称有相似的的克隆效率。但与Phusion DNA聚合酶相比,Taq DNA聚合酶的持续合成能力和保真性都较低。
此外,研究者还发现高浓度的插入片段和较低的退火温度对反应效率非常关键。他们还检测了循环数对转化效率的影响,发现克隆数量在17-18个PCR循环时达到顶点,此后略有下降。插入片段与载体的比例也很重要。研究者检验了三种不同的插入片段/载体比(1:5; 1:50 和1:250),发现比例为1:250时重组克隆数最多。
重叠延伸PCR克隆的主要限制因素是插入片段的长度。科学家们发现克隆的数量随着插入片段长度的增加而有较明显的减少。他们提示插入片段的上限是6.7 Kb。此外这一方法的错误率小于3%。
总之,PCR和克隆工具对基因功能的日常研究极为重要。和其他的长距离PCR技术类似,重叠PCR克隆方法也便于检测和优化,重叠PCR克隆还不需要限制性内切酶或DNA连接酶。因此在制备重组质粒时这一方法简单易用而且非常高效。
- Holton T, Graham M. A simple and efficient method for direct cloning of PCR products using ddT-tailed vectors. Nucleic Acids Res. 1991;19:1156 PMID 2020554
- Haun R, Serventi I, Moss J. Rapid, reliable ligation-independent cloning of PCR products using modified plasmid vectors. Biotechniques. 1992;13:515-8 PMID 1362067
- Bryksin A, Matsumura I. Overlap extension PCR cloning: a simple and reliable way to create recombinant plasmids. Biotechniques. 2010;48:463-5 PMID 20569222 CrossRef