聚合酶链式反应，简称PCR，是一种将几个或几十个拷贝数DNA片段扩增至上百万份拷贝的方法，这是迄今为止最为重要的技术之一。PCR技术的影响不仅仅局限于生物科学领域，几乎人人都可以感受到PCR所带来的改变，在亲子鉴定以及犯罪调查中PCR技术便有广泛应用。而人类基因组计划，这一具有划时代意义的测序工程，如果缺少了PCR技术手段则根本无法开始。

而PCR技术的发明同样有着一个传奇的故事。PCR技术的发明者Kary Banks Mullis讲述过他是如何捕捉到PCR的灵感的：1983年春天的一个晚上，他开着车行驶于加利福尼亚的群山公路之中，那蜿蜒的公路让他瞬间想到了PCR扩增的机制。之后他便不断的实验，最终取得了成功。而PCR技术的成功也让他获得了1993年的诺贝尔奖金。

PCR技术的原理相当简单，只要你明白体内DNA复制的机制便能轻松的理解。我们只是简化了体内的过程并让反应在PCR管中进行。我们知道DNA复制需要DNA模板，短的引物，聚合酶,dNTP以及聚合酶发挥活性的环境，我们优化得到适合DNA聚合酶反应的缓冲液并顺序加入dNTP，特异性的引物以及模板之后便能开始PCR。如果想要提高聚合酶的特异性，你可以尝试各种来源的DNA聚合酶或进行改造。

要开始PCR反应，首先需要将DNA模板进行变性来释放出单链的DNA，这通常需要94或98度的高温；之后将温度降低到50-65度让特异性的引物与单链DNA模板形结合，这一步称之为退火，退火温度取决于引物的特性如长度以及GC碱基的含量。退火之后需要将温度调整到适合DNA延伸的温度，这取决于你选用的DNA聚合酶：不同的DNA聚合酶有着不同的最适温度。当上述的过程完成便称为一个循环。通常PCR反应包含有20-40个循环，这样理论上你可以得到220-40 的DNA拷贝数。

DNA模板，与特定DNA模板结合的引物，去离子水，商业化的DNA聚合酶以及缓冲液，dNTP, MgSO₄（可选）和DMSO（可选）

假设我们已经有了各种试剂和PCR仪，那我们便可以开始PCR实验：将各种试剂混合并按照说明书设置PCR反应。一般PCR循环如下：

1. 起始步骤：这对于热启动PCR而言是必须的，将反应混合液加热至94-98度以激活DNA聚合酶。这一步的时间取决于所选用的DNA聚合酶。
2. 变性步骤：DNA本身是双链结构，而DNA扩增需要引物与单链DNA模板相结合。在这一步，反应混合液被加热至94-98度保持20-30秒以破坏双链间的氢键以便释放出单链DNA。这是PCR循环中的第一步。
3. 退火步骤：变性之后，DNA模板以单链的形式在反应混合液中存在。因为反应体系中的引物与DNA模板互补，当反应温度降至50-65度时，引物与互补的序列形成氢键。退火温度主要取决于引物的Tm值，通常比引物Tm值低3-5度。这一步通常维持20-40秒，而聚合酶会结合至引物-模板双链处开始DNA合成。
4. 延伸步骤：在这一步，DNA聚合酶开始DNA合成，因此这一步的温度选取的是DNA聚合酶的最优温度。通常我们选用72度，但某些DNA聚合酶的最适温度是68度。这一步与体内的DNA复制很相似：DNA聚合酶按照碱基互补规律将dNTPs加到引物的3’末端最终得到新的DNA双链片段。延伸时间取决于目的DNA片段的长度和DNA聚合酶的合成能力。一般而言DNA聚合酶每60秒能够合成1kb长度的DNA。
5. 第2步至第4步称为一个循环：每次循环之后DNA的量均是前一次的两倍。通常一次PCR反应进行30-35个循环。在前几轮的PCR循环过程中PCR产物的量以指数速率增长，但是到了反应后期随着dNTPs和引物的量的减少以及DNA聚合酶的失活，反应速率逐渐下降，因此PCR反应的产量也受到了限制。
6. 最后的延伸步骤：当30-35个循环结束后，我们通常会以68-74度延伸5-10分钟，这是希望使反应体系中残留的单链DNA全部反应完毕。
7. 维持时间：通常我们设置4-10度为反应后PCR产物的保存温度。

PCR反应开始前，你需要准备好DNA模板（基因组DNA或者反转录制备的cDNA）,特异性的引物（手动设计或利用软件设计）并选择合适的商业化DNA聚合酶（根据实验的目的不同做出决定）。

1. DNA聚合酶的选择。市面上有多种DNA聚合酶可供选择，他们的特性也各有不同。因此你需要选择最适合自己实验需要的产品。通常我们将DNA聚合酶分为高保真性聚合酶和普通的Taq聚合酶。如果你希望得到没有任何突变的PCR产物，那应当选择高保真聚合酶。若你只是希望判断特异性序列的存在与否，那普通的Taq聚合酶已经足够。另外要注意的一点是，进行T载体连接的时候，要了解高保真的聚合酶所得的产物是没有A末端的，因此你在T载体连接之前需要进行加A反应。或者直接选用普通的Taq聚合酶。
2. 引物。引物特异性会影响到PCR反应成功的可能性，好的引物设计对PCR成功至关重要。设计引物时，有以下几条原则需要谨慎考虑：
   1. 引物长度。通常PCR引物长度在18-22个碱基之间。这对引物的特异性以及退火温度而言均已足够。
   2. 解链温度Tm。Tm值的定义是使得一半双链DNA解螺旋成为单链DNA的温度。引物的Tm值通常要在52-58度之间。
   3. GC含量。最适合的GC含量为40-60%。
   就目前而言很多软件都可以用来设计引物，如primer5和Oligo。通常这些软件设计得到的引物均可以满足需要。

1. 无条带
   1. 反应体系错误。重新配置反应体系确保各种试剂加入的量没有问题。
   2. PCR程序出错。检测PCR仪程序是否正确。
   3. DNA胶问题。DNA凝胶电泳时加入阳性对照。
   4. 退火温度不合适。以2度为梯度设计梯度PCR反应优化退火温度。
   5. DNA模板量太少。增加DNA模板量。
   6. 引物错误。利用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。
   7. DNA模板中存在抑制剂。确保DNA模板干净
   8. 模板有复杂结构。加入DMSO,BSA或者甜菜碱。可尝试递减PCR。
2. PCR产物量过少
   1. 退火温度不合适。以2度为梯度设计梯度PCR反应优化退火温度。
   2. DNA模板量太少。增加DNA模板量。
   3. PCR循环数不足。增加反应循环数。
   4. 引物量不足。增加体系中引物含量。
   5. 延伸时间太短。以1kb/分钟的原则设置延伸时间。
   6. 变性时间过长。变性时间过长会导致DNA聚合酶失活。
   7. DNA模板中存在抑制剂。确保DNA模板干净
3. 有杂带
   1. 复制提前终止。使用非热启动的聚合酶时常有发生。冰上准备反应体系或采用热启动聚合酶。
   2. 引物退火温度过低。以2度为梯度设计梯度PCR反应优化退火温度。
   3. 反应缓冲液未完全融化或未充分混匀。确保反应缓冲液融化完全并彻底混匀。
   4. 引物特异性差。利用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。
   5. 引物量过多。减少反应体系中引物的用量。
   6. 模板量过多。质粒DNA的用量应<50ng，而基因组DNA则应<200ng。
   7. 外源DNA污染。确保操作的洁净。
4. 条带弥散
   1. 复制提前终止。使用非热启动的聚合酶时常有发生。冰上准备反应体系或采用热启动聚合酶。
   2. 模板量过多。质粒DNA的用量应<50ng，而基因组DNA则应<200ng。
   3. 酶量过多。减少DNA聚合酶的使用量。
   4. 循环数过多。减少反应循环数至30.
   5. 引物浓度不够优化。对引物进行梯度稀释重复PCR反应。
   6. 引物错误。利用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。
5. 阴性对照出现条带
   1. 试剂，枪头，工作台污染。使用全新的试剂和枪头，对工作台进行清洁。
6. 条带大小与理论不符
   1. 污染。使用全新的试剂和枪头，对工作台进行清洁。
   2. 模板或引物使用错误。更换引物和模板。
   3. 基因亚型。对研究的基因进行序列分析和BLAST研究。