精确的蛋白质定量是蛋白质相关实验所必需的，这些实验涉及分子生物学，细胞生物学，生物化学，发育生物学和神经科学的研究课题。 蛋白质定量分析有多种不同方法，包括样品的总蛋白定量和单种蛋白成分的定量。 总蛋白定量的分析方法，包括传统方法，例如测量在280 nm的紫外吸光值，二喹啉酸（BCA）和Bradford检测法，以及其他替代方法，例如Lowry检测法或由公司开发的新型检测试剂盒。针对总蛋白定量分析的每种方法，商业公司都专门开发了方便易用的试剂盒。 单种蛋白质的定量方法，包括酶联免疫吸附试验（ELISA），免疫印迹分析，以及最近的质谱等。 在特殊情况下根据贸易商的规定需要特殊的蛋白定量方法。比如国际血清工业协会（血清供应商组织，www.serumindustry.org）建议采用Biuret法检测血清蛋白含量。

我们讨论蛋白质定量的一些常用方法，并且指出这些方法的用途和局限。值得注意的是，所有这些蛋白质检测方法都既不是蛋白质特异的（一些非蛋白质成分可能会干扰检测值），也不是对所有的蛋白质都同样准确和兼容。此外，某些情况下蛋白修饰会干扰测定结果 [1, 2] 。某些方法如CBQCA法高效测定表面吸附或者包覆蛋白 [3] 。

表一总结了常用的总蛋白定量分析方法。对于每种分析方法的兼容性，研究人员有必要评估检测样品的类型，检测范围和样本量，是否有合适的分光光度计，以及每个检测所需的时间和成本。

因为芳香族氨基酸，酪氨酸和色氨酸，蛋白质在280nm有特征性紫外（UV）吸收光谱。 这通常被用来估计蛋白质浓度。苯丙氨酸和二硫键，在这个波长也有轻微的吸光度。这种方法很简单，而且因为新分光光度计在测量时采用了样品保留系统，所以需要的样品量很小。然而，蛋白质样品必须是纯的，不能包含具有相同吸收光谱的任何非蛋白质成分，例如核酸的污染 [4] 。这种方法是最快速的，但缺点是容易出错。

二喹啉酸（BCA）法是Paul K. Smith于1985年在Pierce Chemical公司发明的。 该公司是BCA检测法的主要分销商 [5] 。BCA检测法和Lowry检测法都是基于Cu²⁺在碱性条件下转换为Cu¹⁺。这种转换被定义为双缩脲反应。该反应受四个氨基酸残基（半胱氨酸，胱氨酸，酪氨酸和色氨酸），以及多肽主链的影响。

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图 1. BCA检测法的示意图

BCA 是Cu¹⁺的一种特定显色剂，在反应的第二步，两个BCA分子和一个Cu¹⁺离子发生反应。Cu²⁺被还原的数量是蛋白质浓度的函数，样品溶液的颜色变化成紫色，可以通过分光光度计测量在562 nm处的吸光度。吸光度与溶液中蛋白质的量是直接成正比的。 通过与已知蛋白标准，例如牛血清白蛋白（BSA）相比较，可估算蛋白含量 [4, 6, 7] 。

在一定范围的离子和非离子型去污剂如NP-40和Triton X-100，变性剂如尿素和盐酸胍，不会干扰BCA分析法，但往往会干扰Lowry等其他蛋白比色测定法（表二） [7] 。某些化学分子，例如还原糖，会干扰BCA分析法。可以通过几种措施消除或减少这些干扰的影响，例如通过透析，凝胶过滤去除干扰物质，或者如果蛋白的浓度足够高，可以通过稀释样品。Reichelt等提出一种可见的简单方法提高检测准确性，特别适用于混合溶液如培养基里的未纯化蛋白 [8] 。他们用一种源于BCA检测方法里的相关因子，BCA蛋白定量的准确率提高了5倍，使BCA法与其它昂贵的方法媲美 [8] 。

蛋白中化学修饰残基是影响BCA法的另一大因素。Brady and Macnaughtan在研究賴氨酰甲基化影响时发现采用BCA法测定甲基化蛋白，蛋白含量均被高估 [2] 。

Thermo Fisher Pierce 最近新推出了改进的Pierce BCA 蛋白检测法，可以兼容还原剂如二硫苏糖醇（DTT），2-巯基乙醇（BME），TCEP和其他二硫键还原剂 [9] 。 BCA检测法是最敏感的蛋白定量法之一（检测下限达到5 ug/mL），变异低于其他方法（Bradford法），而且可以测量的蛋白质浓度范围很宽。

Bradford方法最初是Dr. Marion Bradford 于1976年定义的。是测量蛋白质浓度的最常用方法之一。原理是考马斯亮蓝G-250染料和溶液中的蛋白质结合形成复合物。未结合的染料，有四种不同的离子形式。较蓝的阴离子形式和蛋白质结合，在590 nm处有吸光度。蛋白质浓度可以通过测定蓝色离子形式染料的量，通过分光光度计测量溶液在595 nm的吸光度 [10] 。染料主要是结合于蛋白质的精氨酸，色氨酸，酪氨酸，组氨酸，苯丙氨酸残基 [4] 。

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图 2. Bradford 检测法的示意图

大多数研究人员使用牛血清白蛋白（BSA）作为标准蛋白，主要是因为BSA价格低廉，容易获得，但它并不总是合适的。事实上，BSA作为标准蛋白的缺点之一就是它与染料的结合反应很强，可能导致低估样本蛋白质含量。根据样品蛋白质的类型，可以使用免疫球蛋白G（IgG）或溶菌酶等??其他标准蛋白 [10] 。

Bradford法的一个优点是可以兼容溶液中用于稳定蛋白质的还原剂，而Lowry法不能兼容还原剂，BCA法在一定程度上也不能兼容还原剂。 Bradford法的局限是不能兼容通常用来溶解膜蛋白的低浓度去污剂。然而，可以通过凝胶过滤，透析，或磷酸钙沉淀蛋白质，以除掉去污剂 [10] 。Bradford法的另一个优点是可以检测高分子量（MW）的蛋白质，因为染料不结合低分子量的多肽 [4, 10] 。

在一般情况下，Bradford法是一种快速，准确的测量蛋白质浓度的方法。因此，Bradford法是蛋白质定量检测的最常用方法之一。

Lowry法是Oliver H. Lowry 于1951年提出的，基于两个化学反应。第一个反应是在碱性条件下铜离子的还原，与肽键形成复合物（缩二脲反应）。第二个反应是铜-肽键复合物对Folin-Ciocalteu试剂的还原，致使溶液的颜色变成蓝色，通过分光光度计在650至750nm 的范围检测吸光值 [4] 。使用选定的标准蛋白溶液，例如BSA的标准曲线，估算样品的蛋白含量。

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图 3. Lowry 检测法的示意图

Lowry法的优点在于其灵敏度，最重要的是准确性高。但是，Lowry法比其他检测法所需的时间更长，而且蛋白制备缓冲液中常用的许多化合物（例如，去污剂，糖类，甘油，甘氨酸，EDTA，Tris）都干扰Lowry法并形成沉淀（表三） [4] 。尽管如此，只要蛋白浓度足够高，就可以通过稀释样品，从而减少这些化合物的作用 [11] 。此外，已经证实通过提高温度或使用微波炉，Lowry法所需的时间就能缩短 [11] 。

CBQCA（3-（4-羧基苯甲酰）喹啉-2-甲醛）是一种灵敏的检测蛋白胺显色剂。因为只能检测蛋白中可接触胺，这个方法跟分光光度法有相同的局限性：结果取决于蛋白特定氨基酸的数目。但是CBQCA非常灵敏，能够检测出100μl体积里100ng到1500μg蛋白。此外CBQCA试剂对一些其它检测方法的干扰物质不敏感 [12] ，比如脂质，也能用于检测表面吸附或内包覆的多肽和蛋白 [3] 。

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图 4. 基于PQR的单细胞蛋白定量示意图

许多实验的一个关键步骤是溶液中特定蛋白的定量分析。有几种方法可以使用。常用的方法是酶联免疫吸附试验（ELISA），免疫印迹分析（Western blot）和质谱（Mass Spectrometry）。ELISA和Western blot将在 抗体应用部分介绍；此处简单介绍质谱（MS），详情见Labome综述文章：基于质谱法的蛋白质定量生物分析（Quantitative Bioanalysis of Proteins by Mass Spectrometry）。

蛋白质质谱是蛋白质定量的新兴方法。在蛋白质组学分析中，除了蛋白定性之外，一个重要的步骤就是对特定的蛋白的定量。质谱蛋白定量的方法有很多。常用的方法，较重的稳定同位素例如碳13（¹³C）或氮15（¹⁵N）加入到第一个样本（多肽或蛋白质），而相应的轻同位素例如碳12（¹²C）和氮14（¹⁴N）加入到第二个样本（内标），然后混合这两个样本进行分析。由于两个样本的质量差，用质谱分析仪测定的两个样本峰强度的比值，就相当于其相对丰度比。质谱蛋白定量的第二种方法，可以不用标记样本（即用基质辅助激光解吸/电离 - MALDI分析） [13] 。

这里，我们要强调的是，使用质谱这种通用方法就可以在一次实验中同时定量和定性检测。例如有很多基于质谱的特定蛋白定量分析方法，包括一种定量分析血清中胰岛素样生长因子1的方法 [14] ，一种定量分析尿中白蛋白和血浆中泛醌的方法 [15, 16] 。还包括一些检测更低特异性靶蛋白的方法。在快速发展中，多肽和蛋白的质谱靶向检测指南能确保方法的准确性和可比性。然而，这种方法需要的检测仪器不是任何实验室都能买得起，可能限制了这种方法的使用 [5, 11] 。

活细胞中蛋白表达可以通过基因手段引入特异蛋白监控，比如绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein, GFP）。将蛋白跟具有特定順式作用水解酶连接称作蛋白定量报告分子（Protein quantitation reporter, PQR） [17] ，能让蛋白和报告分子一起转录但是翻译为不同功能的蛋白，这能确保蛋白和报告分子以化学计量比进行表达。因此，蛋白含量可以通过荧光强度推算（图4）。

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图 5. “化学鼻子”技术示意图

前述方法的局限性激发了蛋白质定量分析的新发展。基于纳米颗粒光学性质的方法就是其中之一 [18] 。简言之，分子偶联或颗粒聚集会导致纳米颗粒吸收波长的移动 [19] 。因为吸收光谱在可见光区域，所以颜色变化反映了吸收波长的移动。纳米颗粒通过化学交联跟蛋白质连接，例如抗体、多肽和配体。Rogowski提出了一种用于蛋白质检测和定量的新型纳米传感器，称为“化学鼻子” [20] 。传感器由不同形貌的金纳米颗粒混合而成，跟不同的蛋白质相互作用而生成不同的聚集体（图5）。基于吸收光谱，纳米颗粒可以实现溶液中蛋白质的检测和定量。

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图 6. DNA载体分子通过纳米孔变位示意图（a）；DNA变位产生电流下降峰和DNA负载导致的二级下降（b）；蛋白浓度降低时DNA变位电流变化（c, d 和e）。

Kong等发展了一种基于长链DNA载体分子和固态玻璃纳米孔实现溶液中纳摩尔级别蛋白质的检测 [21] 。其中DNA载体分子可以结合特定位置的蛋白质，在电流的作用下通过纳米孔。DNA在变位时会产生一个下降的电流信号。如果这个DNA吸附了蛋白质则会产生一个额外的下降信号。蛋白浓度越高，吸附在纳米颗粒表面的量就越大，二级电流的降低就会越大（图6）。

Labome随机选取了大量有关总蛋白质检测的同行评审文献。Thermo Fisher Pierce公司 和 Bio-Rad 实验室是总蛋白检测试剂的主要供应商（表四）。BCA法和Bradford是最常用的方法。

几乎所有的BCA蛋白检测试剂都是Thermo Fisher Pierce提供的，BCA 检测法就是该公司的一名科学家在许多年前发明。Thermo Fisher在数年前收购了Pierce。Thermo Fisher Pierce BCA 检测法，用于研究甲状腺癌 [23] ，在细胞分裂中VLDLR的作用 [24] ，S100A4蛋白翻译后修饰 [25] ，hnRNP H 蛋白和 hnRNP F蛋白作为FGFR2（成纤维细胞生长因子受体2）的沉默子 [26] ，子宫内膜异位症中StAR和芳香酶活性增加的机制 [27] ，细胞粘附和铺展中肝素酶（heparanase）的作用 [28] ，经过VES-处理的PC-3人类前列腺癌细胞中NAG-1表达的调控和作用 [29] ，在感光细胞功能中IGF-1R的作用 [30] ，在成骨细胞-破骨细胞的耦合中 Dlx5的作用 [31] ，以及许多其他研究 [32], [33] 。微量BCA蛋白检测试剂盒被用来研究osteopontin在鸟蛋壳腺和蛋壳的免疫细胞化学定位 [34] ，研究大鼠控制皮层撞伤(CCI)后的恢复 [35] ，丙肝病毒核心蛋白的膜定位和病毒扩增 [36] 。

Sigma BCA 试剂 [37] 和Bio-Rad BCA蛋白检测试剂盒也被文献引用。

Thermo Fisher Pierce 也是Bradford 检测试剂盒的主要供应商之一。Pierce Biotechnology Coomassie / Bradford 检测试剂盒被用于研究伴侣蛋白ERp29的表达 [38] ，YKL-40在调节碱性成纤维细胞生长因子的生物活性中的作用 [39] ，以及其他的研究课题 [40, 41] 。

Bio-Rad Bradford 蛋白检测试剂盒被许多文献引用 [42-44] 。 其他供应商也提供了Bradford检测试剂盒，例如， Expedeon [45] 和 Sigma [46, 47] 。

Pierce Lowry assay (产品号 23240) 被文献引用 [47] 和Bio-Rad Laboratories Lowry assay被文献引用 [48, 49] 来定量蛋白浓度。Bio-Rad DC蛋白检测是一个Lowry检测方法的修订版，因与去污剂兼容而大受欢迎。它被用在一些需要蛋白定量的研究中，包括研究人类四跨膜蛋白CD81 [50] 的结构和功能，mdx表型伽马肌动蛋白的骨骼肌特异切除的影响 [47] 和一些其它研究 [51, 52] 。

最好的标准就是目标蛋白质本身。但是通常并不可行。牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA）是最常用的标准物。但有局限性，它在Bradford方法中比其它蛋白质更敏感，蛋白质浓度很可能被低估。此外，BSA作为血清蛋白与很多因子结合，因而无法获得高纯度。其它蛋白如免疫球蛋白（Immunoglobulin G, IgG）和溶菌酶也被用作蛋白标准物。对于给定的实验，根据所研究蛋白和采用的定量方法不同，最优化的蛋白标准物也有所不同。

不能！标准曲线在更低或更高浓度的变化无法确定，因此务必保证样品数据值在标准曲线范围内。通过调整样品或标准物的浓度就可以使数据值在标准曲线范围内。