自顶向下的质谱（MS）技术已经被广泛用于分析完整蛋白。它通常是将反相液相色谱（RPLC)直接与MS偶联来进行操作的。然而HPLC通常需要长梯度持续时间。最近，Michael J. Roth等人将高效Orbitrap MS与表面多孔毛细管RPLC（SPLC)组合在一起来改进该平台的色谱分辨率、灵敏度和重复性 [1] 。

利用自顶向下的质谱技术来分析完整蛋白已经成为一种用于研究发生在蛋白质水平上生物学事件的有效方法。然而利用现有的工具要从复杂混合物中确定几百种内源性的蛋白仍然需要几天的仪器时间。这主要是由于通常需要进行多维度的分离来改善动态范围并由此产生了几十至几百个组份，加重了传统LC/MS平台实验扫描周率的负担。由于蛋白质广泛的理化多样性、它们的翻译后修饰和可能的同分异构体形式导致暴露出来的残基各不相同并会影响柱子的峰容量，所以总是需要较长的梯度时间。

各种具有不同柱子尺寸和固定相的反相树脂已经被用于对完整蛋白进行在线LC/MS实验，诸如整体块硅、聚合型硅、多孔硅和无孔硅等。其中,在一个无孔硅核上覆盖一个多孔硅薄层的表面多孔（SP)RPLC树脂已经被发现具有与那些无孔硅类似的传质效率，且不需要超高压液相色谱装置。这一特点使得可以以高线速度进行分析并用于快速分离，而理论塔板数的增加也是最小的。

Roth等人发展了一种新的LC/MS平台。该平台将Orbitrap MS与毛细管SP RPLC组合在一起用于分析完整蛋白。各项性能指标是通过使用3 min的LC梯度和LTQ Orbitrap XL分离牛泛素、鸡溶菌酶、牛血清白蛋白（BSA）、马心脏肌红蛋白和牛碳酸酐酶的等摩尔混合物来评价的。分辨率为15,000（400 m/z处）的20 fmol输入量的总离子流色谱图的分析结果显示了快速、高分辨的分离效果，半高峰宽(w_h) 也在2.5至5 s。1 fmol输入量中每种蛋白分辨率达到60,000（400 m/z处）的质谱显示信噪比大于5且检出限（LOD)的变化范围为34至536 amol。这与用银染PAGE和MRM分析这些标准蛋白所得到的检出限是可比的。SPLC/MS平台的动态范围用50 amol至200 fmol的稀释系列在三个不同的毛细管柱上进行评估。根据从[M+6H]⁶⁺至[M+10H]¹⁰⁺泛素离子提取到的离子色谱（EIC)峰面积所绘制的校准曲线显示在4000的线性动态范围内有定量的信号增加。为了测试SPLC/MS平台的柱承载量，以峰宽作为泛素上样量的函数绘制曲线。结果显示对于0.8 pg至4.3 ng上样量而言，w_h均为5 s左右。这意味着75 µm I.D.的柱子对于泛素其承载量可达到～5 ng且不会使峰明显变宽。在较低LOD处的重复性是用25个均为200 amol泛素的相同输入量来表征的。对于25个相同样品，[M+6H]⁶⁺至[M+10H] ¹⁰⁺泛素离子的EIC在峰高和峰宽上显示出了很好的一致性。此外，通过Xtract得到了¹²C/¹³C的同位素统计值。其值与理论值相匹配，质量准确度为3 ppm。虽然EIC的峰面积可以用于最具重复性的定量，但由于EIC峰面积计算自动化的困难和进行Xtract计算的速度要求，Xtract的峰高被选择作为用于定量的方法。

为了测试该平台的鲁棒性，～500 ng来自小鼠心脏匀浆的总蛋白用SPLC/MS平台以20 min梯度进行分离。用Xtract对各个质谱扫描结果进行分析后确定了59种不同的、手动确认的蛋白质种类，其质量范围为4.6至22.3 kDa。59种蛋白的w_h的平均值和中间值分别为6.8和5.4 s，这大致与标准蛋白的结果一致。对于该SPLC/MS实验，平均峰容量确定为106种完整蛋白形式。相当于~5×10⁴个细胞的两个Hela S3细胞团的酸可溶性组份也用该SPLC/MS平台进行了分析并使用了20 min线性梯度。总的分析时间为30 min。通过两组不同的分析，MS扫描中共检测到了343种经确认的非重复蛋白形式。在两次测试中发现共有309种共有的蛋白形式，相当于平行样中有>90%的重叠。平行样品中共有蛋白形式的信号强度的散点图显示了很强的相关性，Pearson相关系数为89.9%。此外，5×10⁴个Hela细胞在没有进行核分离的情况下用SPLC/MS平台进行了组蛋白分析。包括H3.1在内的主要组蛋白种类的完整质量标签很容易就被识别出来了。对1×10⁴个细胞进行的三次重复分析得到了可重复的同位素分布图谱。这些结果与之前报道的用靶向分析得到的结果类似。

总的来说，SPLC/MS平台可以为传统的HPLC体系提供高色谱分辨率和速度。该平台可以对来自于全细胞或组织裂解液的复杂混合物中的完整蛋白进行快速、灵敏的分析。其检测限与肽质量指纹图谱、传统的银染凝胶和MRM测试的检测限是可比的，但是其前端样品制备过程要少得多。