干细胞（SC） 的定义如下，它们在未分化的状态下具备自我更新的能力，同时还具备在体外或体内条件下分化成为多种成熟体细胞的潜能。根据它们所能形成的成熟细胞的类型干细胞可以分为四种类别: 胚胎干细胞（ESCs）具备全能性，它们能够分化为所有的体细胞类型 [3] 。 诱导性全能干细胞（iPS）是经过重编程而具备了全能性状态的体细胞，它们被认为与胚胎干细胞有着相同的“干性”因子 [4] 。 而成体干细胞（ASCs） 比如造血干细胞（HSCs） 在分化潜能上通常限定于它们所来源的器官 [5] 。 最后一类是癌症中的某些细胞，它们具备与干细胞类似的特性并表达类似的标记物： 这些细胞（癌干细胞（CSCs））可能促进了肿瘤的发生。

干细胞在治疗人类疾病方面有着很大的潜力因此众多研究集中在干细胞研究领域。 而小鼠是干细胞生物学研究的主要模型, 这使得它们在推动我们对干细胞潜在的治疗应用的认识方面显得极为重要。

在利用畸形瘤获得了经验之后, 两个研究组在1981年独立分离和培养了首例小鼠胚胎干细胞 [6, 7] 。 胚胎干细胞是由胚胎中失去全能性并具备特定细胞命运之前的内细胞团（ICM）组成。 胚胎干细胞是目前研究最多的干细胞, 而大量的研究是在小鼠中进行。 尽管胚胎干细胞分离的效率似乎具有种属依赖性, 小鼠胚胎干细胞是通过相对直接的方式获取的: 小鼠囊胚 （e3.5） 从母鼠的子宫角中取出，透明带用0.5ml酸性台氏液溶解。 然后将剥离了透明带的囊胚在丝裂霉素C失活（或是辐射失活）处理的融合性小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）组成的滋养细胞层上培养数天，这些滋养层细胞在使用前已经预培养数小时（或过夜）。 之后囊胚会进入贴壁状态，贴壁后滋养层细胞和内胚层细胞开始分裂。 一旦内胚层细胞生长到囊胚大小的3-4倍，这些细胞便被挑选出来, 用胰蛋白酶/EDTA小心的处理并吹散,之后重新铺板（图1）。 在合适的条件下分离出的内胚层细胞约有1%会继续分裂并维持未分化的胚胎干细胞形态。滋养层细胞（MEFs）提供的营养因子包括白血病抑制因子（LIF）和骨形态发生蛋白4 （BMP-4）以及其它因子. 除了MEFs分泌的因子，大多数细胞系还需要在培养基中补充这些因子，它们帮助细胞维持未分化的自我更新状态。 尽管在MEF滋养层细胞上培养干细胞是标准的和更为传统的操作步骤, 现在已经有不同的操作步骤能够成功的获得和维持未分化的mESCs生长。 某些mESCs能够在没有MEF滋养层细胞的状态下生长，不过许多细胞会很快的分化虽然培养基中含有LIF。无MEF培养法主要通过如下方式取代滋养层，在培养mESCs之前用0.1%明胶包被培养板30分钟 [8] 。其他的方法包括使用条件性培养基 [9] 以及细胞因子和不同抑制剂的使用 [10, 11] 。 除了上述的外源性因子维持mESC自我更新能力的还有特定的转录网络。 这种转录网络包含有Oct4, Nanog和Sox2，每种因子都会促进自身和彼此的表达从而构成正反馈回路 [12] 。

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图 1. 从ICM细胞中培养ESC。

一旦mESCs被成功分离并且相关的细胞系也得以建立之后, 这些细胞的特征需要加以分析. 有很多种方法可以分析细胞特征，比如核型分析, 拟胚体和小鼠嵌合体。 这些细胞需要经过核型分析以确保它们是整倍体，它们的全能性可以通过体外和在体的多种方式加以验证。 在悬浮培养的条件下ES细胞具有形成类似胚胎的细胞聚集体的能力，这种聚集体由三胚层来源的细胞组成（内胚层，中胚层和外胚层），通常被称作拟胚体 [13] 。为进行在体验证, mESCs被注射进免疫缺陷的小鼠体内，它们有形成畸胎瘤的能力，而畸胎瘤中包含起源于三个胚层的各种组织。向正常的囊胚中注射mESCs可以得到嵌合体小鼠，在包括生殖细胞在内的所有器官中都会有外来mESCs来源的细胞，这表明mESCs具备形成成体动物所有器官的潜能 [14] 。 现在已经有多家商业机构可以帮助学术机构进行相关的检验。

小鼠ES细胞最常见的一种应用是通过将外源的DNA注射进入ES细胞进行基因改造以获得小鼠模型. 目前有多种方式可以实现向ES细胞的基因传递如病毒和非病毒途径。病毒传递时我们会使用病毒基因组做载体（比如腺病毒和慢病毒）, 载体中携带有目标基因，进入干细胞中会开始表达. 非病毒途径更为常见这包括电穿孔转染，脂质体转染以及细胞核转染技术。改造后的ES细胞可以用于上文提到的嵌合体小鼠的构建。

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图 2. 基态多能干细胞和初态多能干细胞的起源和特性. 源自 [1] 。

目前有来源于不同小鼠品系的多种mES细胞系可用，它们经过遗传改造后已被用于构建多种疾病的小鼠模型，当然很明显的一点是ES细胞的遗传背景对特定的疾病模型很重要。 当比较ES细胞系中靶向基因所引起的表型时，不同遗传背景所引起的差异可能会凸显出来。 因此在特定领域的研究中仔细选择细胞系便显得很重要 [15] 。 在疾病相关的研究中与遗传背景相关的各种问题是使用其他类型干细胞如iPS细胞进行研究的重要推动力（如下）。

The Jackson Laboratory有多种商业化的ES细胞系 可供学术机构选择。此外, Invitrogen也提供特定启动子驱动的稳定表达GFP的mES细胞系。 表达GFP的ES细胞系在移植和组织替换的研究中非常有用。最新的研究中可诱导表达特定转录因子（TFs）的mES细胞系已经被制备出来。这些细胞系中所改造的转录因子的选择依据是它们与mES细胞关键的功能以及细胞分化相关如Sox2, Sox9和Nanog。 TF改造的ES细胞系可用于研究ES细胞向特定细胞谱系分化的复杂机制 [16] 。 国家老化研究院提供有这一研究中构建的目前可用的转基因ES细胞系的详细列表 。

mESCs的制备和使用是有一定局限性的。很不幸的一点是并非所有的小鼠品系都有成熟的ES细胞系:只有从有限的几种小鼠品系如129, C57BL/6和BALB/C中能够成功的分离得到mESC。 这使得在其它品系中研究基因的功能和疾病的发生变得困难. 因此研究中需要考虑到ES细胞理论在物种间的适用性。

另一种类型的全能细胞分离自小鼠的上胚层，这是胚胎植入后起源于ICM的单层上皮细胞（图2）。 这些细胞（mEpiSCs）与mESCs在分子和表观遗传学特性上并不相同，因此分别被称为初态干细胞和基态干细胞 [17] ；尽管mEpiSCs具备全能性，不过与mESCs相比它们的发育潜能更为局限。这一新发现为这类细胞在研究中的应用提供了新的见解，因为与mES细胞相比，mEpiSCs与人的ES细胞更为类似。它们与hESCs有着相似的特性比如平面二维（2D）的克隆形态，它们也在相似的生长因子条件下培养。mEpiSCs与人类ES细胞间的这种相似性意味着它们有着功能上的相似性。 mEpiSCs与mESCs一样能够表达Oct4, Sox2和Nanog并在体外分化和在体畸胎瘤形成时能形成所有三个胚层起源的细胞和组织。然而在注射入受体的囊胚后它们不能形成嵌合体，此外 mESCs生长需要LIF和BMP4, mEpiSC和hESCs生长需要bFGF, ActivinA, 或是TGF尾 的混合物以及Wnt信号通路的活化 [18] 。

小鼠中的体细胞核移植

50多年前从青蛙开始，通过实验方式改变细胞命运已经进行了多年。 当一个体细胞的细胞核被移植进卵子替代卵细胞的细胞核, 体细胞原有的命运被移除并随卵细胞获得了胚胎或是多能性的状态。这种从分化状态逆转为多能性状态的方法便是体细胞核移植（SCNT）。 多年来这是获得治疗用的病人特异性细胞系的主要技术手段。 利用SCNT得到的多能干细胞基因完全相同因此将分化后的细胞移植回患者体内后不受免疫排斥影响因而是一项受人关注的技术。 为验证这一概念多种小鼠模型被构建出来尽管通过SCNT构建人的ESCs仍然很有挑战性 [19] 。 iPS细胞作为一种更为实用和成功的方法可能是解决SCNT不足的关键技术。

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图 3. 从小鼠体细胞中制备诱导型多能干细胞. 源自 [2] 。

小鼠体细胞的重编程最早是由Takahashi和Yamanaka在2006年报道 [20] 。 利用逆转录病毒诱导四种转录因子的表达（Oct4, Sox2, Klf4和cMyc）, 研究者成功的将MEFs重编程成为iPSCs。 这四种因子如今被证实能在人的体细胞中诱导多能性。 小鼠的iPSCs与mESCs在多方面高度相似如遗传特性和表观遗传学特性（比如Oct4和Nanog的甲基化模式）,多能标记物的表达,畸胎瘤形成, 嵌合体构建,以及生殖传递。 此外它们也依赖于相同的信号以维持多能性比如LIF。 因此iPSCs与mESCs高度相似，更为重要的是人的iPSCs已经成功的从健康人和疾病患者那里诱导出来，这提供了一种比SCNT更为实用的方法。

自利用MEFs成功诱导iPSCs的那些早期报道以来, iPSCs已成功的从包括角质细胞, 胰岛细胞, B淋巴细胞, 骨髓细胞, 肝细胞, 神经干细胞,和脑膜细胞在内的多种组织中得到 [21] 。 现在已经有多种比逆转录病毒载体更为安全的基因传递方法，这些方法还能预防转入的基因整合入基因组中。 这包括非整合型腺病毒或是质粒瞬时转染以及piggyBac （PB）转座子系统 [22] 。此外使用iPSCs比使用ESCs有更多优势. 首先iPSCs可以实现自体制备，这避免了移植过程中宿主的免疫问题的困扰。 另一个重要的优势是iPSCs避免了ESC使用涉及的伦理问题。

由于能够通过四倍体互补的方式获得完全iPS来源的活体后代，这些细胞是制备与人类疾病相关基因同源的特定基因缺陷的转基因小鼠品系的有用工具。 这些特定疾病相关的iPS细胞可以通过体外和在体的方式进一步研究相关疾病的机理 （图3）。 比如,由于品系的耐受性，通过ES细胞获得的miR-15a/16-1基因缺陷的人类慢性淋巴细胞性白血病（CLL） （CD5+ B细胞恶性） 小鼠（新西兰黑小鼠）模型无法用于研究，但脾基质细胞来源的iPS细胞可用于研究相关的疾病 [23] 。 另一项研究利用了CCR5位点失活的人皮肤成纤维细胞来源的iPS细胞，CCR5位点是已知的HIV入侵细胞的辅助受体。这些iPS细胞被进一步诱导分化为CD34+细胞并形成各种造血细胞群，之后这些细胞可以被移植进入小鼠受体研究CCR5在HIV和AIDS发病中的作用 [24] 。 更进一步的研究用的是镰状细胞性贫血小鼠模型和自体诱导的镰状血红蛋白位点得到更正的iPS细胞, 这些细胞被诱导分化成HSCs并移植进入辐射处理过的小鼠体内, 这些小鼠从疾病恶化的进程中恢复 [25] 。 此外还有多种其它的小鼠模型用于iPSC研究中以治疗多种疾病如1型和2型糖尿病 [26] 。 这类研究有极大的潜力，它们为在动物模型中研究人类疾病提供了一种方法，因为iPS细胞可以从人类的体细胞组织以及多种疾病组织中得到。 尽管如此, 研究者仍需要注意miPSCs和hiPSCs间的区别，以及考虑到基因组完整性的不足，关于iPSC应用的安全性问题仍有许多担忧。因此在它们用于临床之前, 研究者仍需要进一步研究细胞特性背后的具体机制。 为加深这一研究领域的认知，一项最新的研究制备出了ROSA26 iPSC小鼠：这一小鼠模型允许研究者用特定的目标基因替换上述的四种重编程因子 [27] 。 很明显的一点是iPSC研究领域正在以前所未有的速度发展而患者特异性iPSCs的应用也将对人类疾病的研究有极为显著的影响，当然在该技术用于临床之前仍有大量工作要做。

不幸的是现有的癌症疗法无法清除所有的肿瘤细胞，因而剩余的细胞常常会引起癌症复发和转移。 已经有很多研究用癌症干细胞的存在（CSCs） 来解释癌症的起因。 研究者在某些实体瘤中发现了与干细胞具有类似功能特点及标记物的细胞。这包括持续增殖,自我更新以及核心干细胞基因的表达。这些细胞被称为CSCs不是因为它们的起源而是因为它们与干细胞的相似性。 目前对CSCs的认知是成体干细胞，前体细胞或是分化细胞可以通过遗传或是表观遗传改变变成参与肿瘤形成的CSCs。

在小鼠中CSCs的概念已经在骨髓瘤和急性髓性白血病中存在了一段时间，之后在1997年通过将CD34+CD38-细胞亚群移植进入免疫缺陷（NOD/SCID） 的小鼠中，研究者首次在人类中发现了CSCs [28] 。 之后CSCs 在多种人类癌症中被发现，这包括乳腺癌 [29], 前列腺癌 [30], 小肠癌 [31] 以及脑癌 [32] 等癌症。 不过要识别出这类细胞却很有技巧性, 尽管CD44和CD133等标记物能在多种肿瘤中检测到, 癌干细胞还会表达多种组织特异性的标记物如细胞黏附受体, 整合素alpha2beta1似乎是前列腺CSCs的特异性标记物 [33] 。 有鉴于此, 癌症的小鼠模型有望提供更多关于特定癌症细胞起源的有用信息。

乳腺癌肿瘤中的CSC已经在多种小鼠模型中得到了研究 [34, 35] 。比如p53-缺失的小鼠乳腺瘤模型，这种模型被认为与人的乳腺癌非常相似 [36] 。 在这种模型中发现了诱发肿瘤的细胞亚群，它们会表达CD24和CD29 （Lin-CD24HCD29H）。 这一研究中研究者利用体外的非黏附性乳腺球检验和在体移植实验证实这类细胞是CSCs。 这类细胞亚群移植进入正常的健康小鼠体内后会形成异质性肿瘤，这与CSC来源的原发瘤很相似。另外的例子便是MMTV-Wnt1小鼠模型，这种小鼠中发现的Thy1+CD24+ CSC群体富含大量的CSCs [34] 。这一分离的细胞群中, 每200个细胞中会有一个在乳腺脂肪垫移植实验中形成肿瘤，而且肿瘤形态与原发瘤很类似。

在最新的前列腺癌小鼠模型中研究显示恶性肿瘤起始于前列腺导管附近区域，这里干细胞十分丰富 [37] 。 研究表明肿瘤初期的细胞会表达干细胞标记物Sca1。该研究组的早期结果表明在这一前列腺癌的模型中p53和Rb条件性失活，这些基因在前列腺癌发生过程中扮演重要角色。另外一种Pten条件性失活的模型中研究证实干细胞增殖与前列腺肿瘤发生和发展直接相关。比较这两种小鼠模型可以发现尽管它们是相同的转基因小鼠品系（PB-Cre4），他们所形成的肿瘤类型并不相同，这表明这两种模型中干细胞转化的机制完全不同。 这提示研究特定癌症类型的多种转基因小鼠模型是必要的。

最常见的两种脑瘤是神经胶质瘤和成神经管细胞瘤，这两种肿瘤现在已经有多种小鼠模型包括那些带有Pten, Ras, Wnt,和Patched （Ptch）基因突变的模型 [41] 。 有研究组使用Patched突变的成神经管细胞瘤小鼠模型研究显示在小鼠中这类肿瘤受表达前体标记物Math1和CD15/SSEA-1的细胞推动，而人类脑瘤中被认为是CSCs的CD133+细胞却没有效果 [42] 。因此在小鼠模型及人类疾病之间仍有需要解决的矛盾之处。

自多年前发现可能是诱导癌症发生的CSCs以来, 大量的研究尝试着分离和靶向这类细胞希望能够改善人类癌症的疗效。 不过看起来相关的研究仍需要加强特别是考虑到可能存在着许多组织特异性的CSCs，此外在CSC生境方面的研究十分不足，许多问题有待解决。 目前利用不同癌症的小鼠模型进行的研究取得了非常快速的进展，进一步构建相关模型并加以研究将为多种人类癌症干细胞与临床的相关性提供更多的见解。

由于人类疾病发展与小鼠模型中的疾病发生过程并不相同，而非人灵长类的研究存在着伦理问题，因此研究者亟需新的动物模型以便对人类组织和细胞进行在体研究。为此人源化小鼠模型便被构建出来用于干细胞治疗研究，这也使得研究者可以检测新的人干细胞为基础的疗法的安全性和有效性。 人源化小鼠指的是移植了人CD34+ HSCs的免疫缺陷小鼠。缺失了T细胞或B细胞但仍保留了高NK细胞活性的SCID小鼠的出现, NOD 背景上发生SCID突变小鼠的诞生以及更进一步的NK细胞活性急剧降低的小鼠的出现都极大的推动了该领域的研究。 除SCID-NOD小鼠之外，现在已经有更新的如NSG, NOG and RAG小鼠模型被成功构建出来（综述 [43] ）。

人源化小鼠已经被用于多种疾病的研究如人免疫缺陷病毒（HIV）, 关节炎, 肺损伤和脊髓损伤的研究。 HIV预防研究的一个实例便是使用NOD-SCID小鼠并使之通过直肠感染HIV-1。 一组小鼠用tenofovir预处理, tenofovir是一种抗逆转录病毒药物。这可以使HIV-1通过直肠传染的几率从50%降低至8% [44] 。 近期的一项研究也利用了NOD-SCID背景的人源化小鼠研究风湿性关节炎（RA）。 研究者通过在关节处注射弗氏佐剂在这些小鼠中诱导关节炎。. 在关节炎发病之前一组小鼠用TNF抑制剂Etanercept处理,Etanercept是RA患者最常用的治疗药物。 Etanercept预处理的小鼠的关节炎症明显降低 [45] 。NOD-SCID背景的另一种小鼠模型被用来研究脊髓损伤和人iPS细胞诱导的类神经上皮干细胞的移植。 这类移植的细胞会向神经谱系分化并促进肢体运动功能的恢复 [46] 。类似的一项研究用人脂肪来源的干细胞移植治疗急性肺损伤，取得了抗炎应答和肺损伤症状的缓解的效果 [47] 。 这只是目前疾病相关研究中人源化小鼠应用的少数例证； 此外还有多种不同的模型用于其它疾病的研究（表一）。

看起来自从首例人鼠嵌合体构建成功以来小鼠模型研究取得了很大进展. 不过现有的模型仍有诸多限制, 比如残余的小鼠免疫问题仍有待解决。 虽然有不少问题，人源化小鼠正不断的拓展我们对人类疾病应答方面的认识。

精原干细胞（SSCs） 是雄性生殖细胞系来源的干细胞。 它们保证了雄性在成年期能源源不断的产生精子，并且在自我更新和分化的能力方面与mESCs类似。 即便睾丸受到多种损伤之后它们依然能够维持精子发生 [48] 。 SSCs的再生能力可以通过两种不同的方式来展现。 一种方式是通过损伤精子发生比如使用烷化剂来实现, 之后SSCs将重新占据睾丸并形成所有分化的生殖细胞。 另一种可用于检测功能性SSCs的方法是精原细胞移植。 这一技术可检测到那些在睾丸组织中具有持续自我更新能力并产生前体细胞实现精原细胞再生的SSCs。 借助于供体细胞中通过转基因方式表达的不同标记物如GFP或是LacZ, SSCs形成的生殖细胞可以很容易被检测到。 SSCs的标记物包括GFRalpha, Nanos, E-Cad,和Plzf。 小鼠的SSCs跟mESCs一样, 可以在体外几乎无限制的培养并以指数方式扩增，当然它们需要时时给予GDNF和成纤维细胞生长因子2（FGF2）。

研究表明SSC能够在多种物种中恢复精原细胞的发生 [49] 。 这已被证实为一种非常重要的工具，特别是用于癌症治疗引起的不育问题。 虽然现在已经有合适的操作方法用于男性精子的冷冻保存, 不过这些方法并非万能特别对儿童癌症患者而言尤为不适用。 这种情况下必须进行活组织切片检测。 小鼠中一项很有前景的研究表明SSC移植可用于不育治疗 [50] 。近期的研究在高等动物如猴子中取得了类似的结果 [51] 。 不过使用癌症患者的组织仍有局限性, 因为分离得到的睾丸细胞可能会有恶性瘤细胞污染。 近期在小鼠中的工作表明利用癌细胞不同的标记物清楚SSC中的细胞污染是可行的 [49] 。此外,过去的几个月中人-裸鼠异种器官移植被用来检测SSC活性以及组分中可能的恶性瘤污染，研究者采用了FACS方式筛选有肿瘤细胞污染的人睾丸细胞悬液。 这提供了一种分离和富集人类SSCs的方法, 这种方法能去除恶性瘤污染并成功的恢复了小鼠睾丸的功能 [52] 。 这是生育研究中很有前景的进展。

尽管小鼠和人类的ESCs都来源于胚胎囊胚期的ICM，它们的生物学特性有很大差异，研究者已经认识到在两个物种间直接推论是不可行的。 小鼠的ES和iPS细胞呈SSEA-1阳性, 而SSEA-3, SSEA-4, TRA1-60, 和TRA1-81都是阴性。 相反, 人的ES和iPS细胞SSEA-3, SSEA-4, TRA1-60,和TRA1-81都呈阳性, 而SSEA-1呈阴性。 培养过程中hES细胞不需要LIF 然而 mESCs却不能离开LIF（表二）。 与mESCs相比小鼠EpiSCs似乎与hESCs有更多相似之处如扁平的形态, 对FGF2/Activin信号的依赖, 以及对胰蛋白酶消化为单细胞分离状态的不耐受.与mEpiSCs的相似提示hESCs可能更多的是对应于初态多能性而非小鼠ESCs的基态多能性。 小鼠和人的ESCs的分化过程也有不同（表二）这提示我们小鼠中建立和完善的操作步骤可能无法很好的转移到人的系统中。对hESCs特性的进一步分析将推动小鼠模型细胞中获得的知识更好的用于人类细胞。 近期以来多个实验室成功的分离和构建出多种灵长类和人类干细胞系，并且NIH列有有超过 70种不同的细胞系可供使用。有了这些细胞系，对人类疾病做进一步的研究便成为可能。

过去三十年中干细胞研究正以指数的方式进步.在小鼠模型的帮助下,干细胞分离，培养以及移植技术都已经完善。 当然关于ESCs的表观遗传学状态仍缺少认识，比如在培养过程中DNA甲基化会改变的可能性有待研究。如果要将干细胞用于人类疾病的治疗，小鼠模型与人类之间的区别需要做进一步的分析。因此从临床角度上看顺利的将相关的技术转化到人体仍需要时间, 因为仍有许多问题有待解决，比如iPSCs在受体中引发免疫应答的问题以及形成肿瘤的风险。 然而患者特异性的iPSCs的成功将对人类疾病和再生医学研究产生重大影响，当然采取合适的重编程策略以保证不改变细胞的遗传组成也很重要.随着这些技术的快速发展我们有理由相信这些问题会很快得到解决。