本文报导了对551篇用到免疫印迹的正式文献中所用试剂仪器的调查结果，相关试剂仪器如信号检测ECL试剂盒、凝胶制备和预制胶、转移膜。本文也列出来常规免疫印迹的实验步骤，以及实验过程中可能遇到的问题解决方案。
This article reports the survey results for Western blot-related instruments and reagents, such as signal detection kits like ECL, gel preparations and precast gels, and transfer membranes, based on 551 formal publications citing Western blotting. A typical Western blot protocol is also provided and common problems during Western blot procedure are discussed.
化学发光是免疫印迹实验中常用的信号检测手段。表一列出来来邦调查的正式文献中用到的供应商和他们的主要品牌，以及报道文献数。GE Healthcare拥有多种Amersham ECL试剂盒，还有Thermo Fisher Pierce公司的SuperSignal West试剂盒占据着这一领域的供货市场。GE Healthcare的Amersham ECL试剂（Plus最常被引用。注：Plus到2014年10月4日后停止供应，现在的版本为Prime）被用来研究果蝇中CK2激酶的功能特性 [1] ，Vav2和Vav3在皮肤癌中的作用 [2] ，白藜芦醇对肌肉线粒体生物合成的影响 [3] ，Erf2对粟酒裂殖酵母蛋白棕榈酰化和进入减数分裂的调控作用 [4] ，sFLT-1对维持小鼠无血管感光层的作用 [5],突触核蛋白在突触-囊泡模拟 [6] 和信息素配体 [7] 聚集中的作用，FGF21对延长小鼠寿命的作用 [8],脊索动物胚胎锋利边界的形成 [9], 以及转录终止信号的调控 [10] 。截至2014年10月，根据敏感性和信号持续时间，GE Healthcare提供了三种版本的ECL 试剂盒: 调控ECL、Prime和Select。表一列出来GE Healthecare提供的选购指南。
| 供应商 | 主要品牌 | Num |
|---|---|---|
| GE Healthcare | ECL | 205 |
| Thermo Fisher Pierce | SuperSignal West | 139 |
| PerkinElmer Life Sciences | Western Lightning | 27 |
| EMD/Millipore | Immobilon | 9 |
| Santa Cruz Biotechnology | Luminol | 8 |
Thermo Fisher Pierce SuperSignal West ECL试剂 （主要是Femto和Pico）被用于研究mGluR5-Erk对结节性硬化复合物的作用 [11] ，记忆巩固的分子机制 [12] ，阿霉素对肿瘤生长的抑制作用机制 [13] ，ER-tethered EIN2加工和转移的感应 [14] ， cMyBP-C对心肌细胞收缩过程的作用 [15] ， SCN神经元兴奋的调控 [16] ，dSarm/Sarm1信号对轴突死亡的作用 [17] ， CLOCK:BMAL1转录激活复合物的结构 [18] ，以及FKF1对CO蛋白稳定的作用 [19] 。
| 供应商 | 主要品牌 | Num |
|---|---|---|
| Life Technologies | NuPAGE | 81 |
| Bio-Rad | 24 |
SDS-PAGE所用胶可用丙烯酰胺和其他试剂新鲜制备，也可以用供应商的预制胶。Life Tech和Bio-Rad是预制胶的两大主要供应商（表2）。Life Technologies NuPAGE Novex Bis-Tris预制胶（通常为4-12%）被用于研究果蝇CK2激酶的功能特性 [1] ， 胞膜小窝衣壳复合物的结构组成 [20] ， PTC124的药学活性机制 [21] ， Ste5在MAPK失活中的作用 [22] ， 转录终止的调控 [10] ， 维生素K2的功能 [23] ，以及cMyBP-C在心肌细胞收缩中的作用 [15] 。 Life Technologies NuPAGE Novex 3-8% Tris-乙酸盐胶被用于研究果蝇CK2激酶的功能特性 [1] 和Wnt/beta-连环蛋白信号通路对端粒酶的调控 [24] 。Invitrogen NuPAGE 4-20% Tris/Glycine胶被用于免疫印迹实验来研究胞膜小窝衣壳复合物的结构组成 [20] 。
| 供应商 | 主要品牌 | Num |
|---|---|---|
| PVDF膜 | ||
| EMD/Millipore | Immobilon | 47 |
| Bio-Rad Laboratories | Immun-Blot | 12 |
| GE Healthcare | Hybond | 12 |
| nitrocellulose membranes | ||
| GE Healthcare | Hybond | 28 |
| Bio-Rad Laboratories | 18 | |
| Life Technologies | 8 | |
| Whatman | 6 | |
免疫印迹实验中有两种膜可用于蛋白转运：聚偏氟乙烯（PVDF）和硝酸纤维素膜。表3列出来两种膜的主要供应商。EMD/Millipore是PVDF膜的主要供应商。例如，它的止动剂PVDF膜已被用于研究果蝇卵母细胞向胚胎转化中matrimony水平的调控 [25] ， PFK1糖基化对癌细胞生长的调控 [26] ， cMyBP-C在心肌细胞收缩过程中的作用 [15] ， HD6自组装对粘膜天然免疫的促进作用 [27] ，dSarm/Sarm1信号与创伤诱导的轴突死亡相关 [17] ，生发中心B细胞选择中磷酸酶活性的重要性 [28] ，通过特定记忆处理对药物需求的抑制作用 [29] ， 铁离子调控的泛素连接酶在铁平衡中的作用 [30] ，KRAS信号通路突变构建中缺糖损伤的作用 [31] ，以及乙酰肝素酶和基质金属蛋白酶的共调控作用 [32] 。硝酸纤维素膜的第一大供应商是GE Healthcare，品牌为Amersham Hybond。多种类型的膜被用于研究TRAF4在调节紧密连接和促进细胞迁移中的作用 [33] ， 信息素配体 [7] ，MHC I型多肽的蛋白合成启动 [34] ， PD-1对IgA选择和肠道微生物群落组成的调控作用 [35] ，DNA甲基转移酶启动子的转录调节 [36] ，磷酸二酯酶3B的定位及其在调控葡萄糖和脂类代谢中的作用 [37] ，Tulp3作为一种新的副调控因子在调节音猬因子通路中的作用 [38] ，HLA-DR的聚泛素化 [39] ，内衣壳蛋白pUL36和pUL37在HSV-1侵袭中的作用 [40] ，N-Myc下游调控基因2在甲状腺致癌中的作用 [41] 。
- 1x RIPA 缓冲液: 50 mM Tris， 150 mM NaCl， 0.1% SDS， 0.5% SDS， 1% Triton X-100 或NP40.
- 1x PBS 缓冲液: 137 mM NaCl， 2.7 mM KCl， 2.7 mM Na2HPO4， 2.7 mM KH2PO4， pH 7.4
- BCA或Bradford蛋白分析试剂盒
- 1.5 M Tris缓冲液 （pH 8.8）: 90.68 g Tris-HCl to ddH2O， 500 ml溶液pH调节到8.8
- 1.0 M Tris缓冲液 （pH 6.8）: 60.58 g Tris-HCl to ddH2O， 500 ml溶液pH调节到6.8
- 10% APS: 100 mg AP 溶于1 ml ddH2O。 用前准备
- 10% SDS: 10 g SDS溶于100 ml ddH2O。
- 1x Tris-甘氨酸电泳缓冲液: 25 mM Tris， 230 mM 甘氨酸 （pH 8.3）， 0.1% SDS。
- 3x SDS蛋白加样缓冲液: 150 mM Tris （pH 6.8）， 6% SDS， 30% 甘油， 30 mM EDTA和0.2% 溴酚蓝
- 1x TTBS: 25 mM Tris（pH 7.5）: 0.15 M NaCl， 0.05% Tween-20， 0.001% 硫柳汞
- 1x 转移缓冲液: 3 g Tris， 14.4 g甘氨酸和200 ml甲醇，加ddH2O 到1L
贴壁细胞
- 去除培养基，用1X PBS冲洗去掉残留培养基
- 加入预冷的400 ul-1 ml 1X RIPA缓冲液/100 mm平皿。 在冰上孵育5-10 min。
- 完全刮下细胞并转移到在冰上预冷的1.5 ml离心管中。
- （可选）充分混匀或超声处理。
- 4°C下12,000 rpm离心10-15 min并收集上清
- 总蛋白用前需储存在-20°C。
悬浮细胞
- （可选）取出100 ul细胞培养也进行细胞计数。
- 将细胞转移到预冷的1.5 ml或15 ml离心管2000 rpm 4°C离心5 min。
- 去除培养基并用1 ml预冷的1x PBS重悬细胞，然后转移到1.5 ml离心管中。
- 2000 rpm 4°C离心5 min。
- 用1 ml预冷的RIPA 缓冲液/107细胞重悬细胞
- 细胞悬液在冰上孵育并摇床30 min，或充分混匀或超声处理。
- 4°C 12000 rpm离心10-15 min收集上清备用。
- 总蛋白需要在用前储存在-20°C 。
- 组织准备和定量。将组织切成小块。
- 加入500-600 ul预冷的1x RIPA缓冲液/100 mg 组织。
- 将组织充分混匀
- 4°C 12000 rpm离心15-20min。
- 收集上清。
- 总蛋白在用前应储存在-20°C。
| 分离胶浓度（%） | 蛋白大小范围（kDa） |
|---|---|
| 8 | 25-200 |
| 10 | 15-100 |
| 12.5 | 10-70 |
| 15 | 12-45 |
| 20 | 4-40 |
Bradford分析和BCA分析请查看来邦的综述 蛋白定量。
6%-15% 分离胶上注入5%的浓缩胶并插上梳子（10或者15孔）。
| 分离胶（10ml） | 浓缩胶（3ml） | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 6% | 8% | 10% | 12% | 15% | ||
| H20 | 5.3 | 4.6 | 4.0 | 3.3 | 2.3 | 2.1 |
| 30% 丙烯酰胺混合物* | 2.0 | 2.7 | 3.3 | 4.0 | 5.0 | 0.5 |
| 1.5M Tris（pH 8.8） | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 1.0M Tris （pH 6.8） 0.38 |
| 10% SDS | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.03 |
| 10% APS | 0.1 | 0.1 | 0.1 | .1 | 0.1 | 0.03 |
| TEMED | 0.008 | 0.006 | 0.004 | 0.004 | 0.004 | 0.003 |
* 30% 丙烯酰胺混合物（丙烯酰胺:Bis=29:1）
- 2X SDS蛋白上样缓冲液与蛋白样品1:1充分混匀。
- 注胶前先将样品在50-60°C预热。预染Marker可用于监控蛋白分离和转移效率。
- 在1X Tris-甘氨酸缓冲液在60-120V跑电泳1-3小时
将蛋白转移到PVDF或NC*膜上进行抗体检测
- 将电泳材料，如胶、whatman纸和海绵放入1X转移缓冲液中预先浸润.
- PVDF膜应在甲醇中预先孵育10秒到1分钟，然后移入转移缓冲液中
- 将材料按如下顺序放置:板（黑色面）， 海绵， Whatman纸， 胶， 膜， Whatman纸， 海绵， 板（亮面）.
- 将转移装置安置好，黑色面对应黑色电极。
- 转移到冷的1X转移缓冲液中.电转电流和时间应该根据电泳装置的厂家说明推荐设置。
* NC膜不能用甲醇孵育。
- 按照推荐浓度或根据结果优化浓度，将一抗溶于1X TBST+3% BSA中。
- 在4°C孵育过夜或更长时间，或者在室温下4小时。
- 回收一抗，保存在4°C。然后在室温下在摇床上冲洗膜三次，每次5-10 min。
- 将二抗放入1X TBST中稀释，然后室温下孵育膜1小时，或4°C摇床上2-4小时。
- 在室温摇床上用TBST洗三次，每次10 min
- 检测的二抗用错了（明确一抗制备的宿主）
- 一抗或二抗的浓度太低（提高浓度再试一次）
- 一抗不能识别检测物种的蛋白（检查一抗的特异性）
- 上样蛋白量太少（增加样品的量）
- 转移效率太低（改进转移实验步骤。确保PVDF膜用之前用甲醇预孵育）
- 一抗已经被用很多次了（使用重新稀释的一抗）
- 封闭时间太长或者洗涤次数太多（减少封闭时间和洗涤次数）
- 检测试剂盒失效（加入阳性对照并确保试剂盒有效）
- 叠氮化钠可能抑制二抗（溶解缓冲液中应避免使用叠氮化钠）
- 一抗或二抗的孵育时间太短（延长孵育时间）
- 封闭时间太短或者封闭缓冲液有问题（延长封闭时间或者用BSA代替脱脂奶粉）。
- 一抗或二抗浓度太高。（降低抗体浓度）
- 洗脱不充分（增加洗脱次数）
- 孵育温度太高 （确保一抗在4°C孵育）
- 膜使用错误或者膜已经干了 （避免膜变干）
一抗或二抗浓度太高（降低抗体浓度）
电泳电压太高，或者电泳过程中缓冲液温度太高。（降低电压，电泳缓冲液置于冷的环境中）
- 一抗或二抗浓度太高（降低抗体浓度）
- 上样蛋白量太大 （降低上样量）
转移不均衡（确保膜均衡的贴到胶上，没有气泡）
一抗或二抗浓度太高（降低抗体浓度）
平衡时间不够，或者胶与膜的接触不均衡。（确保胶没问题，改进转移步骤）
胶与膜之间有气泡（确保胶与膜之间没有气泡）
- 一抗特异性差（更换一抗）
- 一些蛋白可能移动与理论大小差别较大。
翻译后修饰例如多聚（ADP-核糖基）-PAR链（它能够介导蛋白分子带负电荷）不能通过SDS-PAGE分别 [42]. 不过它们能通过CTAB-PAGE分开 [42]. CTAB， 溴化十六烷基三甲基铵 （(C16H33）N(CH3)3Br， cetyltrimethylammonium bromide， hexadecyltrimethylammonium bromide）是一种基于氨阳离子的表面活性剂。