哺乳动物培养细胞内制备短发夹RNA和转基因的技术 由短发夹RNA介导的序列特异性基因沉默已经成为了一个用于研究基因功能的有用工具并预期会成为另一种可用于药物开发的方法。然而，对于科学家而言，要在哺乳细胞中使所需的短发夹RNA得到均一表达还是很困难的。最近，Piyush Khandelia等人发展了一种高效率低背景（HILO)的重组介导的盒式交换（RMCE）技术。该技术可以辅助在几天内生产出包含有强力霉素可诱导的所需短发夹RNA的均一细胞池。 [1]

RNA干扰（RNAi)是一种由双链RNA介导的序列特异性基因沉默技术。该技术一直被广泛用于研究各种基因的功能。在哺乳细胞中引发RNAi通常会使用两种分子：1)通过化学方法或酶反应产生的小干扰RNA和2）可以通过胞内RNAi机制产生小干扰RNA的基因编码的短发夹RNA。由于成本相对较低并可能可以实现持续可控的基因沉默，在高通量的功能丧失筛选以及基于RNAi的治疗中总是倾向于使用短发夹RNA的方法。此外，短发夹RNA方法中产生脱靶效应的风险要低得多。

然而，要快速制备表达有所需短发夹RNA的均一细胞群并不是一项容易的任务。目前，只有几种细胞系用质粒DNA进行瞬时转染时其效率可以达到RNAi的要求。在这种依赖于质粒或病毒载体进行转基因的稳定表达方法中存在另外一个问题，就是在基因组上的整合通常是随机的。由于表观遗传的沉默作用，这种随机性会影响到所需转基因的表达水平。因此，现有可以用于制备表达短发夹RNA的细胞群的方法总会涉及到费时费力的富集过程。虽然流式细胞仪被报道能辅助对那些表达有所需短发夹RNA并具有最佳剔降作用的细胞进行筛选，却不能用于以阵列形式进行的中产或高通量短发夹RNA筛选。另外，编码短发夹RNA的病毒载体需要高滴度的储存液，这需要考虑到生物安全问题。

重组介导的盒式交换（RMCE)利用位点特异性的重组酶将两侧有两个自兼容但互不兼容重组位点的供体序列整合到一个预先设计好的并且有一对类似重组位点的受体位点。Khandelia等人组建的由慢病毒载体编码的卡式盒含有人的EF-1 alpha启动子和一个夹在LOX2272和LoxP这两个互不兼容的Cre重组酶特异作用位点之间的杀稻瘟抗性基因（Bsd)。这个卡式盒再被转到六种常用的人类细胞系和五种常用的小鼠细胞系中。相应的RMCE供体质粒（pRD1)含有一个嘌呤霉素（Pur)抗性基因。为了防止非特异性的整合发生，Pur基因前面的启动子被一个强多聚腺苷酸信号所替代。用pRD1和编码野生型Cre重组酶的质粒对受体细胞系进行共转染就会产生嘌呤霉素抗性的克隆。

为了使这一体系适合用于产生可诱导的短发夹RNA，Khandelia等人用RIPE卡式盒对pRD1进行了改善。该卡式盒含有一个组成性表达的反向四环素反式作用因子基因(rtTA3)和一个可以被四环素诱导的并且包含有短发夹RNA克隆位点以及EGFP表达标记的元件。为了提高反应效率，Cre蛋白的N端也加了一个核定位信号。通过流式细胞仪和落射荧光显微分析，加入rtTA3的诱导剂强力霉素（Dox）后，确认RIPE编码的EGFP在>97%的重组细胞中都有表达。在一个演示实验中，表达有相应短发夹RNA的细胞中荧火虫荧光素酶的表达被下调了3.45倍。这一策略也被用于测试下调人的RNA结合蛋白PTBP1、Argonaute蛋白Ago2/Eif2c2和人末端尿苷酰转移酶家族中每个成员的表达。

尽管成功地下调了一些基因的表达，在HILO-RMCE平台中，短发夹RNA的表达被认为会受到前病毒整合位点的影响。因此，需要通过筛选一些受体克隆来进一步优化RNAi的效率。

除了短发夹RNA，这一平台也可以用于表达其它的遗传元件。为了实现这一目的，Khandelia等人设计了三种基于pRD1的供体质粒。这些质粒中包含有各种基因并受一个组成性启动子的调控。所有测试的转基因表达都可以很容易地被检测到。

总的来说，由于其成本效率以及技术的便捷性，HILO-RMCE技术为快速制备含有强力霉素可诱导的短发夹RNA的均一细胞群提供了一个理想的平台。而且，它还可用于制备基本上可以表达任何感兴趣的转基因的细胞群。