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1. 碳酸盐包被缓冲液: 3.03g Na2CO3, 6.0g NaHCO3, 溶解于900ml双蒸水中，检测并调整pH至9.6，定容至1L；
2. PBS：1.16 g Na2HPO4, 0.1 g KCl, 0.1 g K3PO4, 4.0 g NaCl ，溶于500mL 蒸馏水中，调整pH至7.4；
3. 封闭液：溶于PBS的1% BSA，血清，脱脂牛奶，酪蛋白或明胶等。
4. 洗涤液：PBS或是TBST（Tris-HCl,pH7.4 + 0.05% 吐温20）
5. 抗体或抗原稀释液：1×封闭液
6. 终止液：根据实验检测系统可采用不同的终止液。

1. 直接法
   1. 确定抗原浓度和包被抗原：
      1. 采用十字交叉连续稀释分析法确定抗原浓度，抗原浓度一般为0.2 to 10μg/ml，最好不要超过20μg/ml。
      2. 将50μl用碳酸盐包被缓冲液稀释的抗原加入96孔酶标板中，用塑料膜板将孔板覆盖后置于室温2小时或4度过夜。
      3. 弃去包被液用洗涤液洗涤3次，轻拍孔板使洗涤液甩干。
   2. 封闭
      1. 每孔中加入200μl封闭液（1%BSA或5%脱脂牛奶等），盖上膜板，室温封闭至少2小时或4度过夜。
      2. 封闭后用PBS洗涤两次。
   3. 抗体孵育
      1. 每孔加入稀释好的抗体100μl，室温孵育2小时或4度过夜。
      2. 孵育后用洗涤液洗涤四次。
   4. 检测

      每孔加入100μl的底物溶液，待显色充分后加入100μl的终止液并在酶标仪上测定相应波长吸光度值。

2. 间接法
   1. 确定抗原浓度和包被抗原：
      1. 采用十字交叉连续稀释分析法确定抗原浓度，抗原浓度一般为0.2 to 10μg/ml，最好不要超过20μg/ml。
      2. 将50μl用碳酸盐包被缓冲液稀释的抗原加入96孔酶标板中，用塑料膜板将孔板覆盖后置于室温2小时或4度过夜。
      3. 弃去包被液用洗涤液洗涤3次，轻拍孔板使洗涤液甩干。
   2. 封闭
      1. 每孔中加入200μl封闭液（1%BSA或5%脱脂牛奶等）室温封闭至少2小时或4度过夜。
      2. 封闭后用PBS洗涤两次。
   3. 一抗和二抗孵育
      1. 每孔加入100μl稀释好的一抗，盖上膜板，室温孵育2小时。
      2. 孵育后洗涤液洗涤四次。
      3. 加入100μl稀释好的标记二抗，继续孵育1-2小时。
      4. 洗涤液洗涤四次。
   4. 检测

      每孔加入100μl的底物溶液，待显色充分后加入100μl的终止液并在酶标仪上测定相应波长吸光度值。

3. 抗体夹心法
   1. 包被抗体
      1. 将50μl用碳酸盐包被缓冲液（pH 7.4）稀释的抗体加入96孔酶标板中，一般抗体浓度为1-10μg/ml。
      2. 盖上膜板包被4度过夜。
      3. 弃去包被液用洗涤液洗涤2次，轻拍孔板使洗涤液甩干。
   2. 封闭，加入样品
      1. 每孔中加入200μl封闭液（1%BSA或5%脱脂牛奶等）室温封闭1-2小时或4度过夜。
      2. 每孔加入100μl稀释好的样品，37度孵育90分钟。
      3. 甩去孔板里面的溶液，洗涤液洗涤2次。
   3. 孵育检测抗体和二抗
      1. 每孔加入100μl稀释好的检测抗体，室温孵育2小时。
      2. 孵育后洗涤液洗涤四次。
      3. 每孔加入100μl稀释好的标记二抗，继续室温孵育1-2小时。
      4. 孵育后洗涤液洗涤四次。
   4. 检测

      每孔加入100μl的底物溶液，待显色充分后加入100μl的终止液并在酶标仪上测定相应波长吸光度值。

4. 直接细胞ELISA
   1. 胰酶消化并收集细胞，采用十字交叉连续稀释分析法确定细胞个数和标记抗体的浓度。
   2. 将消化下来的细胞4度离心，1500rpm，5min。
   3. 细胞重悬并计数。
   4. 每孔100μl细胞悬液加入酶标板中，1500rpm离心1min后将上清液真空吸干。
   5. 用100μlPBS稀释的抗体标记物溶液重悬细胞，4度孵育90分钟。
   6. 孵育后4度1500rpm离心1分钟，用洗涤液重悬，重复三次。
   7. 每孔加入100μl底物溶液并室温孵育1小时。
   8. 显色并测定吸光度值。
5. 间接细胞ELISA
   1. 将细胞样品4度离心，1500rpm，5min。用洗涤缓冲液重悬，使细胞密度为1-5 × 106个/ml。
   2. 采用十字交叉连续稀释分析法确定细胞个数和标记复合物的浓度。
   3. 每孔100μl细胞悬液加入酶标板中，1500rpm离心1min后将上清液真空吸干。
   4. 每孔用100μlPBS稀释的检测抗体溶液重悬细胞，4度孵育90分钟。
   5. 每孔加入100μlPBS稀释的酶-抗体复合物，4度孵育90分钟。
   6. 重悬，洗涤三次。
   7. 每孔加入100μl底物溶液并室温孵育1小时。
   8. 显色并测定吸光度值。