最近,中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所开发了一种新型的免疫检测固相载体材料。这种名为iPDMS(聚合物涂层聚二甲基硅氧烷)的材料,可实现高灵敏性,高专一性,零背景(低于仪器检测限)的生物标志物检测 [1] 。该方案可应用于多指标的酶联免疫吸附试验(ELISA)中。
蛋白质芯片技术由于其快速,高效,高通量,近年来被应用于检测疾病有关的标记物或筛选蛋白质-生物分子的相互作用等领域。为了进一步提高蛋白质芯片检测的灵敏度和专一性,很多研究组都致力于提高抗原抗体配对亲和力,提高信号放大效率,和增加结合比表面积(如磁性粒子)等方向。
除了以上这些方面,降低检测背景,特别是蛋白质非的特异性吸附(NPA)造成的噪音,也是在实现高灵敏和高通量免疫测定的关键。在临床应用通常试用高浓度的酶连标记的抗体来检测生理液体中痕量的标记物。而NPA通常与蛋白浓度之间是正相关关系,一般的信号放大方法,在放大信号的同时,也能放大这种基于NPA的噪声。这些因素都会造成不可忽视的背景并限制了免疫测定的灵敏度。
传统蛋白质芯片的固相载体材料从表面形貌来分,可以分为平面(如玻璃)和多孔(如硝酸纤维素)两种类型。前者的由于比表面积较小,载样量少,信号较弱。而后者需要繁琐的封闭和清洗步骤来抑制严重的NPA,这些步骤耗时耗力,不但增加了检测成本,而且增加了不可控因素。
聚乙二醇分子在溶液中能防止NPA。通过表面引发的高分子反应,可在聚二甲基硅氧烷(poly(dimethysiloxane),PDMS)表面聚合上一层以聚乙二醇为侧链的甲基丙烯酸酯(p(OEGMA)),这层高分子经过表面等离子共振检测表明可以有效防止NPA。这个体系中,PDMS本身是一种广泛使用的有机硅弹性体,在这里作为蛋白质固定的基底材料;p(OEGMA)聚合物层可通过反应条件控制来得到合适的厚度和亲水性;而假三维微米水凝胶表面提高了表面比表面积以获得更高的蛋白承载量。
具体的检测方法以免疫夹心法为例,羧基官能团化的iPDMS表面首先进行NHS/ EDC活化以促进与蛋白的结合。然后用点样仪将捕获抗体微阵列化在iPDMS表面上。基片避光静置过夜,使蛋白质重构并稳定固定在表面。接下来将iPDMS片夹合在一个48孔的塑料夹盒中,将表面分割成48孔板。剩下的操作流程与传统的孔板免疫检测方法类似:将目标液(如血清),检测液(如酶标抗体),和化学发光底物依次添加入孔板中并检测。
p(OEGMA)表面在溶液中可防止目标蛋白或酶标检测抗体的非特异性吸附并保持整个检测过程的零背景。而点样过程中,纳升级别的捕获抗体溶液在p(OEGMA)表面可迅速蒸发并干燥,此时p(OEGMA)丧失该功能,所以蛋白可通过化学键合和物理吸附联合作用稳定固定在iPDMS表面。
为了证明iPDMS可以实现高灵敏,高通量的免疫检测,我们构建了一个多指标联合免疫诊断芯片:我们在iPDMS平台同时检测11种肿瘤标志物(AFP, CEA, CK19, c-PSA, NSE, SCC, CA 15-3, CA125, CA 19-9, CA 242, 和β-HCG),并和硝酸纤维素膜平台进行全方位的对比。iPDMS在检测中有如下优势:
- iPDMS即使在高浓度蛋白及复杂的血清体系里,仍然表现零背景,而硝酸纤维素膜即使在严格的封闭条件下,仍表现出随蛋白浓度提高而升高的背景值。
- 与硝酸纤维素膜相比,iPDMS信噪比要高10左右。针对11个不同的标记物,检测限则低至83%-5%不等(最低检测限19pg/mL),这点在某些低丰度生物标志物定量检测中会更有优势。
- iPDMS消耗的捕获抗体只有硝酸纤维素膜〜1/16到〜1/250。iPDMS不需要繁琐的洗涤程序或封闭步骤,可以节省大量时间和费用。
基于iPDMS的免疫固相载体提供了一个零背景,节约成本和时间,并可与经典的ELISA方法整合的免疫微阵列芯片平台,可用来高灵敏度,高通量地检测各种生物标志物。它可以每孔同时检测多达100个不同的蛋白质,可用做蛋白质的高通量筛选;而应用在临床诊断中,它更节省时间和费用,有很大的应用潜力。
- Ma H, Wu Y, Yang X, Liu X, He J, Fu L, et al. Integrated poly(dimethysiloxane) with an intrinsic nonfouling property approaching "absolute" zero background in immunoassays. Anal Chem. 2010;82:6338-42 pubmed