从1968年 最早的商品化 流式细胞术（FC）和荧光激活细胞分类术（FACS）诞生以来, 它们已得到大大改进。但要成为实验室广泛接受的技术，除成本因素外，还存在不少障碍。技术上的问题主要是细胞内低丰度分子的检测，缺少“通用”细胞通透物质，细胞自发荧光的干扰效应，荧光分子间发射光谱的重叠，以及缺少可识别目标分子的试剂。特别是对于细胞分拣来说，由于液滴的形成收集、分拣细胞重分析或培养前的稀释，以及为获得足够数量的可用细胞需要的时间延误的原因，还存在细胞存活问题。最后，特别是在处理低丰度对象时，数据分析也是很棘手的。

有一篇关于 流式细胞仪理论的不错的综述，介绍了流式细胞仪的操作语言。此外，Labome.com还有另一篇文章涵盖了提供流式细胞仪所用特定试剂的 主要抗体供应商。本文将聚焦于以下几点: 1）硬件的选择和注意事项，2）流式细胞仪和细胞分选的实际问题和，3）数据分析和软件。这几个话题包含的内容不展开论述，希望读者在着手开展表一列出的一些流式细胞仪应用研究前，了解一些注意事项。

在决定需要什么实验设备的时候，细胞生物学家需要了解自己的预计需求和预算。表二列出了市场上可有的选择。由于这些设备会不断更新，建议到制造商网站查询最新的升级。

做小颗粒分析的专业公司（JSAN, Partec, Accuri）将他们的服务定位于个体实验室或需对其细胞分拣仪做恒定质量分析的实验室。他们通常会用到改进的更小的激光二极管和微流体。但如果需要做每日监控或者对大型项目（如临床试验）的多台仪器的数据进行比较，其软件没有大公司的强大。一个建议是确保仪器输出文件能够同您打算使用的收集后分析软件兼容。

研究人员对研究对象进行了分类，超大型（浮游生物、母细胞、早期胚胎），非常小（微粒、细菌）或者高度不对称（精子、肌小管）。确保您将要使用的仪器以前在这一应用中被成功使用过。喷嘴直径、流动细胞的几何形状、流速、液滴大小、检测器位置都会影响到结果。

再生医学和癌症治疗研究通常要求对细胞进行分离以确保纯度、细胞活力，并且便于在流式细胞仪实验室和病人间运送。Closed cartridges（Owl，Cytonome公司） 似乎是制造商为解决这一问题的一个尝试。另一个途径是提供带有无菌罩或者可匹配标准尺寸无菌罩的细胞分拣仪。

有几种可增强流体流动的技术，如声学对焦（Life Technologies公司）、等压射流（Stratedigm公司）、毛细管（Millipore公司），或微流控技术（几个还在开发中）。它们大多已在其他设备上应用，却未必已用于流式细胞仪。为便于使用者获得及时反馈，我建议本文读者加入 普渡大学流式细胞仪订阅。许多流式细胞仪方面的领军人物都会定期在该论坛上提供有价值的信息。其他博客，比如Google+，也有类似功能，但它们缺乏普渡团队的深度和广度。

另外，还有一些有意思的技术在这一领域也很有影响。首先，利用Miltenyi或其他公司的磁珠对目的细胞做预纯化或清洗可提高分拣效率。当然，仅仅利用一轮或多轮磁珠筛选而不用流式细胞仪，许多研究也能开展起来，但这不是本文讨论的重点。Amnis 公司已将流式细胞仪射流与荧光显微镜和数字成像整合在一起。其结果是一系列单个细胞的图像能够显示荧光团的分布，而非简单的平均荧光指数（MFI）。DVS Sciences已极大地扩展了可用质谱（MS）检测结合报告抗体的金属螯合物的靶标数。目前有33种不同的金属可被同时检测。该仪器被Time of Flight 称为"Cytof" [1] 。考虑购买该仪器的研究人员应该确保他们有这一深度的细胞分析需要。此外，细胞在等离子体中会被汽化，所以用于研究的细胞不能恢复。

细胞分拣仪制造商有一点不能达成共识，激光检测是在细胞通过喷嘴后的液滴中（空气中的蒸汽），还是液滴形成前的流动细胞内，完成效果最好。如图1，（上图）一个蒸汽系统（Influx，也可能是FACSCalibur或其他设备），（下图）一个流动细胞系统（BD公司的 FACS Aria III）。

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图 1. 蒸汽的（顶部）和流动的（底部）细胞分拣装置的光学构造。BD Biosciences®转载许可。

这两者各有优势和局限。蒸汽分拣仪硬件设备简单，检测点与收集装置间距离较短，检测样品的激光数多。而流动细胞分拣系统通过比色皿提供层流和增强的样品聚焦。然而，流动细胞长度有限，而且激光光学装置需要足够空间避免不同通道间的串扰。对于敏感性来说，流动细胞系统明显占优，但蒸汽系统没有保持细胞清洁的问题，并且能提供额外的激光束。需要指出的是，有些激光束本身对细胞有毒害作用。

细胞悬浮于液滴中，然后使其经主脉冲自由下滴（或提供压力）。有关液滴如何带点和偏向的问题，请参考Labome其他流式细胞仪的文章 图7。

此外，关于培养基种类和细胞存活体积的问题。相关文章和普渡大学网站有大量关于培养基的建议，但培养基通常会选用牛胎儿血清（FBS）。将细胞收集到11 x 75 毫米或更大的管中，需要用到0.5 - 1 mL的牛胎儿血清。对于多层平板来说，牛胎儿血清应该占一半的体积，因为还要考虑平板干掉的问题。而如果仅仅是收集核酸，用于细胞裂解和核酸提取的同样的产品就可以了。此外还建议对进一步处理的细胞在营养丰富的生长培养基中进行复苏。

所有的流式细胞仪制造商都在增加分拣细胞存活方面取得了很大的进步。微流体方面的最新进展可能使不通过液滴形成做细胞收集成为现实。不管答案是否是毛细管-基础系统或基于微通道的系统，都必将规避分拣时的细胞压力问题。

除非你用病人血清建立诊断检测，不缺少提供流式细胞仪抗体的公司。请见Labome文章 列表。然而，并非所有这些公司都有相同克隆-并且不是所有克隆在流式细胞分析中作用方式相同。如果文章中没有列出想要的克隆，而你又想运行相似的实验，请联系作者找出使用的哪一克隆。

多数公司不会公开抗体纯化和标记的方法，但如果你是从一个声誉较好的公司购买，同一克隆标记相同的荧光基团就可以了，除非是在发货途中受损，微生物污染或者保存不当。按照制造商建议的储存条件，抗体至少能保质一年。

然后，你应该决定你的实验是否要用荧光直接标记的抗体，或者用二抗，生物素-链霉亲和素，或其他配体-受体。除非您的实验室预算紧张，应使用直接标记的抗体。直接标记的抗体背景较低，没有裂解细胞释放的生物素造成干扰，重复性较好。

另一种选择是用标记试剂盒或者第三基团标记的抗体，如 SoluLink或其他的。一些抗体制造商也提供用户定制标记，但应认真考虑公司在抗体标记方面的声誉如何。所有的化学基团各有优劣，因此需要慎重考虑交联剂（请见Thermo Fisher Pierce 实用指南。

有五种基本类型的荧光染料：小分子染料（如荧光异硫氰酸酯/ FITC和Alexa染料），蛋白染料（藻红蛋白、别藻蓝蛋白、绿色荧光蛋白），串联染料，其中蛋白染料收集荧光，将它传输至小分子染料，然后串联染料发出同小分子染料（如APC-Cy7）量子点和多聚染料（ 亮紫）相同波长的光波。所有的都各有优点和缺点，但蛋白染料和小分子染料在流式细胞仪中使用时间最长。

我们很容易就能观察到标记的大分子蛋白（> 100 kD）、疏水性染料或聚合物是如何改变单克隆抗体活性的。为说明相对相对大小，图2显示了一个抗体分子与一个蛋白分子共轭的结构（在这种情况下辣根过氧化物酶“只有”44 kD）。我们可以得出这样的结论：最安全的方法是使用以前别人用过的同一克隆抗体和荧光染料结合的抗体。但是，我们为什么不能创造出一种独特的抗体呢-通过表达细胞或非表达细胞共轭组合并表征其特异性，然后滴定抗体最大化其信噪比，这样你的实验室就有一个新的试剂了。

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图 2. SoluLink®转载许可。

试验中选择荧光染料基于以下几点：1）流式细胞仪或细胞分拣仪上可以用什么样的激光器和滤波器，2）目标相对丰度-更亮的荧光染料应该用在低丰度的分子上，3）靶标是否在细胞内。胞内靶标被包埋于细胞中，所以应该使用最亮的荧光染料。

两种激光仪器，比如Guava® EasyCyte 或者BD® FACSCalibur 只能使用四种荧光染料，所以染料选择就像设置一个可用荧光染料基质并设其为检测目标一样简单。PE通常是最亮的，其次是APC，因此它们应该被连接到胞内或低丰度的抗体上。想了解发射光溢出量，例如PE通道中的异硫氰酸荧光素，我们可以参考光谱分析 Invitrogen公司或者 BD公司。

如果超过两种激光/四种颜色，我们就必须考虑自动还是手动补偿了。 [2, 3] Fluorescence minus One （FMO）可以控制 [4] 分析仪器-特定波长、强弱和荧光染料的重组。对于这些问题，我建议阅读相关文献并咨询您的流式核心管理层和内部专家。

使用的固定剂几乎都是多聚甲醛、PFA或者甲醛。这三种名字的固定剂都会用到，但其活性成分是相同的。固定剂应在磷酸盐缓冲液（PBS）中稀释至1-4%，固定过程通常在冰上进行。如果是激酶或磷酸蛋白，其磷酸酶需要迅速失活，因此PFA通常在37℃下使用。

甲醛可与伯胺作用，因为抗体含有结合位点通常带有静电相互作用，赖氨酸固定修饰可避免抗体与固定蛋白结合。这也是为什么根据已有实验方案可以节省时间和试剂的原因。显然，固定（包括通透）会迅速杀死细胞，因此如果下一实验步骤是细胞分级分离或核酸提取，通常会先对固定细胞进行分拣操作。

根据目标抗体是否分泌并在高尔基体内滞留，激酶或磷酸化蛋白是否需要磷酸酶抑制剂，核蛋白是否需要磷脂双分子层部分溶解和DNA松弛，细胞透化需要选择不同的方式。所有这些方法都会用到去污剂或酒精，去污剂最温和，而酒精特别是甲醇最强效。

当目标在胞质内时，首先需要用到最温和的去污剂皂素。低浓度，通常0.1%的皂素，对胞内细胞因子着色就足够了 [5] 。一些非离子去污剂，如Triton X-100、吐温80也有使用，但皂素是最常见的选择。

对于激酶和磷酸化蛋白来说，相关技术来自斯坦福大学的Gary Nolan 实验室 [6, 7] 。磷酸酶被PFA和预冷酒精灭活，酒精也可以作为二次固定和强效通透的试剂。文章中建议70%-100%浓度的酒精，而70%和90%浓度的酒精最常见。也有通透前先染色的例子。在去污剂和酒精中滴定抗体的网站-基于协议，可以在 Cytobank找到。分析深度的例子请见图3。

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图 3. Cytobank深度数据分析。 Cytobank。

用甲醇或乙醇作为透化剂可以作用核内目标。乙醇对于扩增细胞-特异性作用于Ki-67更好一些 [8] ，但甲醇用的更多。并非所有抗体都结合PFA-甲醇固定细胞，因此许多单抗供货商会提供一个相容性的表。然而，如果荧光剂是蛋白，在细胞用抗体染色前必须确保甲醇已经去除干净，因为很多蛋白对醇类的脱水作用比较敏感。

醇类脱水作用的另一个受害者是那些细胞内表达用于流式细胞分析的荧光蛋白。它们包括绿色荧光蛋白、mCherry和Cerulean3。如果荧光信号被醇类处理破坏，就需要用到荧光蛋白抗体来检测变性荧光蛋白了。

非结合染料在 早年是第一种用于流式细胞分析的细胞染色试剂。下面介绍的用到的染料可以分成活体染料（vital dyes）、核酸插入染料（nucleic acid intercalating dyes）、谱系染料（lineage dyes）、阳离子和pH通道染料（cation and pH flux dyes）、外排染料（efflux dyes）和细胞器染料（organelle dyes）。只有最常用的或者首次用到的染料才会被提及，如果想查看其他的来源，请参见 分子探针。备注：分子探针® 有15种染料。

台盼蓝（Trypan Blue）是第一种被发现不能进入活细胞而能自由进入死细胞的染料。PubMed上有一篇参考文献提及它的使用可以追溯到1914年，第一篇用于流式细胞分析的文献可以在上面Beckman Coulter链接中找到。而最早将台盼蓝作为活体染料的文章可以追溯到1980年 [8] 。从那以后，碘化丙啶（PI）和7-氨基放线菌素D（7-AAD）也被作为了活体染料的选择 [9] 。7-AAD在流式细胞分析中往往较少会外溢到临近的通道中，因此明亮的DNA染料和另一种柔和的并且有重叠发射光谱的荧光分子一起使用的时候，一定要多加小心。

溴化乙锭（EtBr） 和碘化丙啶（PI）能够结合到DNA双螺旋的大沟。4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）和Hoechst染料（有几种常用的）则结合小沟。请注意，一些染料 （例如碘化丙啶）也会结合到RNA发卡结构形成的沟中，因此如果要做DNA定量，需要用染料和RNA的混合液。其它染料，如7-AAD，不会与DNA大小沟结合。

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图 4. 典型的Cytobank数据库热图。

DNA 染料也用于细胞周期分析、染色体倍数分析和基因组大小量化。对于这些研究，通常会用到上面提到的DNA染料，但数据分析要求非常苛刻。幸运的是，有一篇很好的文章详细概述了这一过程 [10] 。

细胞凋亡测定就用到了流式细胞仪的多个特性。与DNA结合而不透细胞膜的染料可用于鉴定晚期凋亡和坏死细胞。识别细胞周期蛋白（聚合酶的裂解结构和磷酸化组蛋白H3）的抗体都可以购买到。最早的细胞凋亡标记是磷脂酰丝氨酸（PS）溢出，它通常只在细胞质膜内膜上存在。溢出被检测到，却并非用的抗体，而是通过一个Ca2+依赖的结合蛋白，膜联蛋白V（Annexin V）。这一分子可以购买到，通常连接几种不同的荧光剂，它已经成为研究细胞凋亡的支柱。膜联蛋白V的详细分析请参见 [10] 。

谱系染料，例如羧基二醋酸琥珀酰亚胺酯（CFSE）利用膜渗透结合蛋白，然后通过琥珀酰亚胺酯与邻近蛋白作用。一旦被染色，细胞经过几次分裂后仍然是染色状态，因为跟细胞分裂消耗的时间相比，蛋白质的更新更缓慢。

钙离子（Ca2+）用Fura-2和Indo-1染料检测 [11] ， 它们需要紫外线激发，因此许多流式细胞分析常用的染料在它们身上却不能使用。Magnesium Green和 一些Fura-衍生物已经被成功用到检测Mg2+上 [12] 。其中有些是在可见光谱中激发的。对pH值测定的荧光染料从1979年就开始使用了。要收集实时数据，您的流式细胞仪要能显示带有时间轴的数据，收集率也必须在您想要测定的时候可以兼容多个样品。

几种正常和转化细胞能够运输有机化合物到细胞外。当细胞发生癌变时，这是极其重要的，从细胞中移除的分子可以作为化疗药物。然而，该转运过程在正常细胞中也能被发现，包括干细胞。一些外排的分子还具有荧光活性，有转运活性的细胞外观不同，当这些染料存在的时候，可通过流式细胞术分离。最常用的染料是Hoechst 33342，有转运活性的细胞被称为“侧群（SP）细胞” [13] 。

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图 5. 典型的批量分析堆叠直方图。

标记细胞器的方法有三种。首先，可以用质粒载体转染细胞，该载体上携带荧光蛋白基因，以及将蛋白质同特定细胞器分离的足够肽段信息。第二，有结合细胞器的抗体 - 特异性标志物，但它们需要细胞有通透性。染料往往使用简单，稳定，荧光比多数荧光蛋白更明亮，一些可用于活细胞。Molecular Probes®提供多种染料，包括产品明细一个有用 网站。一些常用的染料有：用于线粒体的红色或绿色MitoTracker；用于氧化状态线粒体的Dihydrorhodamine 123；LysoTracker Green和Lysosensor Green；用于内质网的DIOC染料，以及作用于高尔基的BODIPY染料。

软件使得围绕数据分析的问题变得稍稍简单了，这也是本文这一部分要讨论的主题。然而，大多数软件以最适合硬件的方式来匹配特定仪器的操作和数据分析。在众多厂商里，根据收集的信息是模拟的还是数字的，数据有很大的差异。庆幸的是，有一些不错的第三方软件程序包，有一个甚至是免费的，并且他们几乎不受仪器限制，能够开展多数想要的数据分析。

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图 6. DeNovo软件得出的流式细胞分析结果。

即使考虑到以上所列的困难，我们仍然不能将用这些仪器收集到的信息的广度和深度细化为生物学或医学的重要性的问题。在（ PubMed）搜索"flow cytometry" OR "FACS"的综述文献能找到许多这一话题的文章，其中这两种方法中的一种或者两种都有所使用。表一为通过这种方式找到的应用列表。

应使用流式细胞仪或细胞分拣仪自带的软件控制仪器，除非有令人信服的理由不要使用第三方软件。通常这涉及到购买仪器制造商不再支持的用过的仪器。多数机器特定的软件允许进行一些分析。一台双激光台式仪器可能没有边缘切割补偿、标准化和统计软件包。其次，有些软件可能有大多数功能，但缺乏一个你需要的手稿或演示文稿。第三，可能你的合作者有一台不同的仪器，但你需要与他共享数据。最后，你可能有数量有限的仪器软件副本，但也有许多用户想在他们自己的电脑上处理数据，而不破坏原始数据。表三是主要的软件套装和它们应用的仪器。

首先，需要考虑仪器的类型。较旧的仪器，如BD FACS Calibur和FACScan，将数据处理为模拟信息。较新的仪器，如目前市场上大部分仪器，将数据处理为数字信息。模拟仪器输出是一个FCS 2.x文件，它几乎可以被任何分析软件包读取。数字数据可以导出为FCS 2.x或3.x文件，一些较旧的分析程序不能解析FCS3.0数据。一个例子是一个由Joe Trotter编写的免费软件包，可从 WinMDI下载。它可以在Windows 95和NT上运行，网上也有讨论它可能可在XP上运行。也有一个为老式Macintosh计算机上运行SoftWindows编写的Intel 80286版本。

不幸的是，即使两台仪器生成同样的FCS 3.0数据，却并不意味着人们可以自由地分享不同制造商仪器之间的数据。通常情况是文本格式的问题，可能有一些网上资源可以将一台仪器特定格式的文件转换成另一台仪器的。三个仪器独立包可以自动或有小的应用程序为用户这么做。

数字数据的优势是什么？最重要的是，每个数据点（细胞）包含相关数据，这样，如果您将数据加载到分析软件包，包括补偿在内的几乎所有参数可以修改。 FCS 2.x数据不能恢复为预补偿条件，重新分析就受到限制了。

当然也有软件包可以填补现有的分析或演示选项的缺口。其中有两个例子，BD Biosciences的CytoPaint （ Leukobyte）和 Paint-A-Gate ，允许进行批处理聚类分析和展示/ 另一个则是 Phoenix Flow Systems它在扩增和DNA分析的时候非常有用。

目前，用于分析和数据共享最好用的免费软件包是Cytobank，上面展示了它的细胞分拣（FACSelect）功能。对那些打算研究信号转导分子运行细胞内流式分析的研究者来说，Cytobank能够与他们进行数据共享，FACSelect就是其中一个例子。上传的数据是保密的，可以将其标记为公开，或只与特定的合作者共享。这样，数据可以是限制的，完全不受限制的，或限制只向同行开放。Cytobank集成了所有必备工具：补偿、限群、设置层次结构、显示事件子集表、创建等值线图和热图、叠加直方图。图4是Cytobank数据的热图。

Cytobank确实提供了一个基于订阅的高维数据集的功能。该软件被称为 "SPADE"。

FlowJo是目前最常用的流式细胞数据分析软件包。程序安装在个人电脑上，TreeStar可以跟随目前数据分析和演示的趋势。 FlowJo site提供了一个30天的试用版本10（苹果版是9.6）。这本手册有一个令人印象深刻的新功能列 表。不用说，建议在购买前先试用一下。图5是批处理分析产生一系列层叠直方图。流式细胞仪会快速生成大量数据。分析大量批处理样品，然后以一种有意义的方式将它们展示出来是任何流式细胞分析软件包的必备能力。

还有一个不错的选项是DeNovo 软件的FCS Express在线数据包。一位代表堆叠柱状图产生的一个批次analysisThe的替代方案，也是一个非常不错的选择，是在网上包FCS快速从头软件。它也有一个令人印象深刻的功能列表，并且还产生了出版物 - Ready图形。图6示出了此分析软件包的功率，并获得的数据时，在接近瞬时的钙的细胞内的波动。请注意，X轴是时间和更迅速的细胞讯问，更有意义的数据。它也有一个令人印象深刻的新功能列 表，也生成直接用于发表的图形。图6展示了此分析软件包的强大，对几乎瞬时的细胞内钙波动获得的数据。请注意，X轴是时间，细胞检测的越快，数据越有意义。

请注意，FCS Express已经适应了它们的图像分析软件，这一类型数据不断涌现，因此如果一个人要从尖端仪器上生成数据，必须留心，需匹配软件的数据类型。

总结软件部分，流式细胞仪会产生海量的数据。 导出的FCS标准数据能够直接与不同仪器中的结果进行整合。仪器特异性的和仪器通用的分析软件包给新用户的是安全感的假象。要生成大量的数据并不难，但如果我要试图解释这些数据，实验的、收集的和分析的变量却是无穷的。要学习如何选择正确的试剂，适当的处理细胞，设置仪器最优化您的应用程序，补偿和运行恰当的控制，阐明数据的意义，这些技能的获得都需要耗费时间。除非你不打算运行四个以上的荧光染料并且所有的染色都是在细胞表面，最好是跟有经验的使用者紧密合作，能避免所有自学者犯的常见错误。如果你打算做细胞分拣并希望最后保留活细胞，这些是尤为重要的。

请看表一列出的30多种流式细胞的应用。找出最接近您的研究兴趣的一个，然后在PubMed 或谷歌学术上做快速的文献检索。确保"cytometry"为关键词。留心在最近的几篇文章中数据的展示方式，了解试剂的数量，所用仪器的复杂性，以及数据是如何被呈现出来的。然后回到本文中，看看我界定的新用户和有经验的用户可能会面临的所有潜在风险。对流式细胞仪的分析时间，试剂（和同种型对照，补偿珠，以及其他试剂和缓冲液）的成本做出估计。然后根据您的特定需要对其进行修订，安排少数有经验的使用者运行程序。这是我希望给那些刚进入该领域或者将要开展从简单分析到复杂多色实验的使用者推荐的最低限度的准备。一旦您完成了上述的准备工作，表四列出了文中讨论的供应商和制造商的网址。