许多组蛋白的各种翻译后修饰（PTM）（即甲基化，乙酰化，泛素化和SUMO化）发生在赖氨酸位点 [1] 。虽然在被覆盖的组蛋白折叠域内发现了少数的修饰位点，但是翻译后修饰在柔韧的N-末端尾部区域却是相当普遍的。许多组蛋白修饰能够调节染色质结构中重要的功能性变化，并通过直接地改变染色质结构/动态变化或通过招募组蛋白修饰蛋白和/或核小体改构复合体来实现 [1] [2] 。

组蛋白翻译后修饰已经被发现能影响许多基于染色质的反应，包括转录，异染色质的基因沉默和基因组稳定性 [3] [4] [5] [6] 。由于能影响到整个转录程序，与基因表达相关的修饰尤其具有特殊意义。在多种体外模型中，组蛋白翻译后修饰代谢途径的缺陷与基因表达失调有关。这在某些情况下也与人类疾病相关，并已在免疫缺陷和各种人类癌症中得到验证 [7] [8] [9] [10] 。因此，组蛋白标志物是如何被调节的以及如何影响PTM-特异性结合蛋白的相互作用将继续成为重大的研究领域 [11] [12] [2] [13] 。

确定组蛋白翻译后修饰的功能往往涉及到研究修饰的丰度和结合伴侣。这里所描述的方法将对这些方面进行论述，其中包括了详述组蛋白纯化方法、制备位点特异性修饰的重组组蛋白、基于多肽的PTM结合蛋白表征体系以及染色质免疫共沉淀样品不同分析手段的实验方案的总结和参考文献。

通过免疫印迹来检测组蛋白修饰时可以用经SDS Laemmli样品缓冲液提取得到的全细胞裂解液。对于动物细胞株而言，离心得到的细胞可以直接在样品缓冲液中重悬并煮过后上样 [14] [15] ;然而需要注意的是，一些实验方案中还会推荐在提取步骤后对样品进行超声处理。除了碱性预处理步骤是可选的以外，真菌蛋白提取物可以用同样的方式来进行准备 [16] 。然而，如果实验上必须尽量减少样品处理时间的话该步骤是可以省略的。只要注明该步骤的省略以及后续实验样品均以同样方式处理即可。提取之后再通过离心除去样品中的不溶性组分，将可溶性的全细胞提取物留在上清中。

在一些实际应用中，有必要检测富集有组蛋白的组分或纯化的组蛋白；富集的样品可以是分离得到的细胞核或者是染色质的粗提取物。从后生动物细胞或者酵母中提取细胞核十分简单，基本上只需要三个步骤：低渗膨胀（酵母要先将细胞壁消化掉以后）、利用机械力剪切进行细胞膜裂解（例如用杜恩斯匀浆器进行破碎或者在旋涡混合器上温和震荡）和通过离心分离细胞核 [17] [18] （图1A）。染色质粗分离也是很简单的，只要在去垢剂裂解步骤后用离心将染色质沉淀即可 [19] [20] [21] （图1B）。

一些现有的组蛋白纯化实验方案是相当好的，并且易于遵循 [18] 。在这里介绍的方法中，组蛋白是使用稀硫酸溶液从细胞核中提取的，然后通过柱层析纯化（图1C）。此方法的优点在于核酸和许多非组蛋白由于在酸性pH值下是不溶的，可以很容易地通过离心来去除掉。可溶的含有组蛋白的组分就可以用 三氯乙酸（TCA）来沉淀，并且如果需要的话，可以通过一个反相高效液相色谱柱的方法来纯化。这样提取出来的组蛋白，可用于多种应用，包括免疫印迹和质谱。请注意有一篇文献 [18] 还介绍了另一种高盐组蛋白提取方法。

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图 1. 分离完整细胞核（A），准备原始的染色质部分（B），纯化组蛋白（C）的实验步骤。

组蛋白的翻译后修饰一般是通过抗体检测的。抗PTM抗体的质量和特异性，应在实验应用之前仔细评估。要考虑的问题包括：其它组蛋白修饰位点的交叉反应、对未修饰（重组）蛋白的识别以及与核中其它物质的交叉反应。这种类型的评价程序也非常简单，涉及到对核提取物进行针对于重组组蛋白的免疫印迹或对点在硝化纤维膜上的一组修饰过的和未被修饰过的多肽进行免疫印迹。

最近为了解决抗PTM组蛋白抗体的质量问题已经对200多个针对57种不同组蛋白修饰的抗体进行了表征 [22] 。该报告的补充数据记录了不同抗体在斑点杂交，免疫印迹（在不同的物种中），染色质免疫沉淀（ChIP）测试中的性能。这是该领域中极好的一种资源，作者也鼓励他人通过用抗体验证数据库 [23] 来记录新的测试结果为这一领域做出贡献。对斑点杂交实验方案的描述以及该研究中得到的斑点杂交图像中可以在 [24] 中找到。

有一种用来制备位点特异性修饰组蛋白的方法涉及到蛋白质片段的体外连接 [25] [26] [27] [28] [29] （图2A）。这种方法的前提是将一种人工合成的、修饰过的肽段（对应到蛋白质的N-或C-末端）通过化学方法连接到含有其余蛋白质部分的重组片段，然后对全长度连接产物进行纯化 [30] 。最近报道了一个相关的方法，描述了利用天然的化学连接，通过依次加入对应于连续的蛋白质部分的合成肽段来制备一个全合成的修饰组蛋白 [31] 。

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图 2. 通过表达蛋白的连接（A）和体内直接纳入（B），来生产位点特异性修饰的组蛋白。

此外，通过化学连接，使用经遗传改造过的、能在UAG密码子处应引入乙酰化赖氨酸的大肠杆菌可以通过体内直接引入来制备赖氨酸乙酰化的组蛋白 [32] （图2B）。这一系统的前提是要将一个已经经过序列优化的M. barkeri吡咯赖氨酰-tRNA合成酶变异体导入到大肠杆菌内，从而使识别的tRNA CUA带上乙酰化赖氨酸。因此，为了产生一个位点特异性乙酰化的组蛋白，只需要在菌株中加入待修饰位点含有UAG密码子的构造就可以了。

当感兴趣研究一个蛋白质与内源性组蛋白之间的相互作用时，有必要先用微球菌核酸酶(MNase)将染色质消化成单核小体大小的片段。感兴趣的蛋白可以从可溶性的含有染色质的组分中免疫共沉淀下来，然后通过免疫印迹来评价与核心组蛋白的结合以及和不同组蛋白修饰的关联 [33] [34] 。利用已经在含有核小体的可溶性组分中孵育过并纯化出来的重组诱饵蛋白，该实验同样也可以通过pulldown测试来完成 [35] 。如果特定的修饰明显富集于含有靶蛋白的复合物中，就可能会有兴趣用修饰过的多肽在结合测试中对这种相互作用进行表征（见下文）。在无法确定这种倾向性的情况下，仍然会有兴趣知道这种结合是否为修饰依赖性的。相较于未修饰过的组蛋白，与修饰过的组蛋白的相对亲和力可以利用天然组蛋白和重组组蛋白在结合测试中加以确定 [36] 。

从组织培养细胞中纯化天然组蛋白的一个普遍的方法是用微球菌核酸酶（MNase）限制性消化或者机械打断来产生寡聚核小体大小的染色质片段，然后将片段在羟磷灰石(层析)柱上进行色谱分析并在高盐中洗脱 [37] [38] （图3A）。当重组组蛋白以单体形式过度制备时是不可溶的，但是可以从包涵体中回收过表达的蛋白 [39] [40] （图3B）。首先，可以从分别过表达每种组蛋白的细菌培养物中得到包涵体。组蛋白再从包涵体中提取出来，经连续离子交换树脂纯化，并采用线性盐梯度进行洗脱。要生成组蛋白八聚体的话，等摩尔的H3，H4，H2A和H2B要先展开、组合、通过透析复性，再经分级柱纯化。

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图 3. 分离天然的（A）和重组组蛋白（B）的纯化方案。

蛋白对修饰的偏好性可以通过比较该蛋白对不同修饰的多肽的相对亲和力来确定。这可以用几种不同的方法来实现。有一种方式是利用固定在珠子上的多肽将一个待测蛋白拉下来-使用重组蛋白或核提取物-并使用免疫印迹来测定蛋白质的相对回收率 [41] [42] [43] （图4A）。将短肽作为诱饵分子的原理也已被用于无偏实验中，用以发现以前未知的组蛋白翻译后修饰结合蛋白 [44] [34] [45] [35] 。在该测试中，相对于未修饰过的多肽或在不同氨基酸上带有相同修饰的多肽而言，根据在修饰过的多肽上的富集可以确定核提取物中的结合蛋白。

在文献中还介绍了能够同时筛选探针蛋白与多个多肽间相互作用的基于阵列的方法（图4B）。对于这样的实验，感兴趣的蛋白孵育在一个多肽微阵列的表面，该多肽微阵列基本上是一块经抗生蛋白链菌素包被的且点有不同的生物素标记的多肽的载玻片。蛋白质多肽复合物可以用结合有荧光基团的抗体和阵列扫描仪检测，从而实现可视化 [46] [47] [48] 。利用一个相反的装置来进行研究，例如用荧光标记的多肽去孵育蛋白质阵列，也同样被提到过 [49] 。

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图 4. 使用肽为基础的pulldown分析（A）和肽芯片分析（B）来鉴定组蛋白修饰。

富含有特定翻译后修饰的基因组位点可以通过将含有感兴趣的标记的染色质片段进行免疫沉淀来确定，然后再对与该翻译后修饰相关的不同位点其所占的相对比例进行定量（图5）。许多实验室已经制定出了详细的染色质免疫沉淀(ChIP)实验方案，可以在网上 [50] [51] 或文献 [52] [53] [54] 中找到。

大多数染色质免疫沉淀实验方案的第一步是用甲醛处理细胞，通过交联将染色质结合蛋白的位置“冻结”。后生动物来源的细胞就可以直接进行裂解，而酵母细胞则必须先要进行细胞壁破碎，这可以通过机械力剪切或酶消化来完成。取决于检测所需的核苷酸分辨率，染色质可以以两种方式之一来切成小片段：通过超声打断来得到200-500bp长的片段或者用微球菌核酸酶消化成单核小体。除了洗脱步骤后洗脱液需要65度孵育过夜进行解交联外，对提取物进行免疫沉淀的操作与传统免疫沉淀实验完全一样。第二天，样品用蛋白酶K处理后进行酚/氯仿抽提，以回收共沉淀下来的DNA片段。

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图 5. 染色质免疫共沉淀(A)用于分离共纯化的DNA片段，而这可以用PCR（B），染色质免疫共沉淀-芯片（ChIP-chip）（C），或者染色质免疫共沉淀-测序（Chip-seq）来分析其序列和富集程度（D）。

如果只是想分析某些位点的翻译后修饰水平，可以通过实时定量PCR或在溴乙非啶染的凝胶上对PCR产物进行定量来实现（图5B）。简而言之，从免疫沉淀产物和投入组分的稀释液中将待分析位点扩增出来并进行比较，最好是针对于组蛋白免疫沉淀平行样中带有翻译后修饰的这些组分。为了确定翻译后修饰在一个特定位点上是否有富集，标准化的PTM/组蛋白比例需要同附近经预测没有相应翻译后修饰区域的比例进行比较。

基于微阵列的方法能够对许多位点的组蛋白修饰富集情况同时进行分析。微阵列本身是一种包被的玻璃载玻片，其上附着有不同的寡核苷酸–其数有几万至数千万。蛋白质富集的位点可以通过将荧光标记的来自于免疫沉淀产物和投入组分的DNA一起共杂交到阵列上并比较阵列上标准化的免疫沉淀/投入荧光强度比来确定(图5C)。

要准备用于微阵列分析的DNA时，第一步是从每个测试（免疫沉淀产物）和对照（投入组分）样品中扩增出所要的DNA并将扩增产物用两个不同的荧光基团分别标记。DNA扩增可以用多种方法来实现，基于PCR的方法是先将引物结合位点加到DNA两端。这部分可以通过将DNA连接到序列已知的短接头上 [55] 或者使用含有3’兼并序列和5’已知序列的引物先进行两轮退火和延伸 [56] [52] 。末端带标签的产物就可以用能识别加入接头序列的引物再进行几轮PCR进行扩增。

DNA扩增的另一个广泛使用的方法涉及到将DNA转换成转录模板，再用T7 RNA聚合酶转录从而对产物进行线性扩增 [57] 。首先，将短的polyT尾巴添加到DNA 3'末端来产生一个可利用Klenow进行第一链合成的引发位点。用于引发的寡核苷酸中在基础T7 RNA聚合酶启动子序列的3’端有一串A，这能使得第一链的产物能通过体外转录来进行后续的扩增。

PCR扩增得到的样品可以通过以下两种方式之一进行荧光标记：（1）在最后一组PCR中引入荧光基团修饰过的dNTP或者（2）使用氨基修饰的dNTP，之后间接地再将染料偶联上去 [51] 。 除了修饰过的核苷酸是在最后的反转录步骤中被引入的以外，同样的标记原理也可用于通过转录进行扩增的产物 [51] 。在准备用于标记的样品时，重要的是还应标记一个可以与待测样本一起共杂交的合适对照样本。因此，标记通常设置成两个样本中一个用Cy3标记，另一个用Cy5标记。在最后扩增或标记完以后，将样品进行纯化，再将已标记的待测和对照样本混合在一起，准备进行杂交。

大规模富集分析也可以利用大规模​​并行DNA测序方法来进行。这些方法可以对数百万的DNA分子进行实时并行测序。迄今公布的ChIP-seq研究绝大多数是使用Illumina “边合成边测序”的平台来完成的 [58] 。这个平台的基础是在一个芯片表面对几百万的DNA克隆簇进行并行测序（图5D）。

ChIP-seq样品的准备是先将免疫沉淀下来的DNA连接到寡核苷酸接头分子上，之后将连接产物（在某些实验方案中）用PCR扩增几轮，然后再纯化 [59] [60] 。样品然后再注射到表面包被有与连接产物接头序列互补的寡核苷酸的芯片上。锚定的寡核苷酸的密度可以保证在扩增步骤中新合成的分子均出自于附着在临近芯片表面的引物，使得DNA在空间上始终靠近父模板。实验方案的测序阶段则是利用荧光标记的且可以可逆性终止延伸过程的核苷酸进行单碱基延伸来完成的。因此，测序反应过程是按如下进行的：一个带标记的核苷酸添加到游离的3'末端，随后延伸暂停，以便检测掺入的核苷酸。接着，终止基团被切除掉，从而可以加入下一个核苷酸。核苷酸延伸需要再重复几个循环，通常会产生40bp左右的读长。关于新一代测序方法以及与基于微阵列的方法进行比较的进一步探讨，请参阅 [56] [57] [58] [59] 。

一篇最近发表的文章表明，由于染色质状态可能偏差 [60] 。开放的染色质区域往往会导致假阳性，并应当对计算的方法作出调整。