microRNA研究试剂综述
王秀英 (mary at labome dot com)
美国新泽西州普林斯顿合原研究有限责任公司 (Synatom Research)
译者
王秀英 (mary at labome dot com)
美国新泽西州普林斯顿合原研究有限责任公司 (Synatom Research)
DOI
http://dx.doi.org/10.13070/mm.cn.2.129
日期
更新 : 2014-12-11; 原始版 : 2012-10-19
引用
实验材料和方法 2012;2:129
英文摘要

A summary of reagents for microRNA research cited in a randomly selected set of peer-reviewed publications.

有关Labome调研的文献

Labome调研了截止2014年8月5日前的10422篇抗体应用的文章(请阅 来邦是如何选择这10000篇论文的?)。在这些文章中,总结了2348篇文章中的所有试剂(包括抗体)。其中有25本杂志中的65篇文章明确引用了microRNA。表一和表二列出了这65篇文章中包含超过一篇文章的杂志名称及其出版年限。

年份数目
20031
20062
20073
20087
200927
201014
20114
20124
20134
表一:Labome调研的microRNA的文章数。
下面总结了这些microRNA文章中用于microRNA研究的试剂。文章中包含的关于试剂类型、研究方法和供应商方面的信息是随机的,从而可以概括(虽然列出的不全)用于microRNA研究的试剂。
杂志名数目
Science13
Proc Natl Acad Sci U S A11
RNA5
Genes Dev3
PLoS ONE2
eLife2
Am J Pathol2
表二:关于microRNA文章的期刊的文章数。所列期刊包含多于一篇的文章,其它未列的期刊仅包含一篇文章。

多数文章研究了某些特定microRNA在正常或病理过程中的作用,例如miR-9在人单核细胞和中性粒细胞 [1] 和神经干细胞命运决定中 [2] miR-9,miR-181a and b, miR-204,miR-199b,miR-135a 在胚胎干细胞分化中 [3] microRNA-10a 在人乳腺癌细胞中 [4] miR-15a,miR-18a,miR-30b,miR-99a,miR-182和miR-199a在听觉发育和功能中 [5] ,miR-15b和miR-16在人胃癌细胞中 [6] ,miR-16作为羟色胺转运体调节因子 [7] miR-21和miR-31在卡波济氏肉瘤相关的疱疹病毒感染中 [8] ,miR-18a和miR-19a在人成神经细胞瘤中 [9] ,microRNA miR-26a在高分化神经胶质瘤中 [10] ,miR-27a和 miR-451在人癌细胞中 [11] , miR-27在疱疹病毒 感染中 [12] , mir-29 在细胞凋亡 [13] 和肺癌中 [14] ,miR-32和 miR-106b-25在前列腺癌中 [15] ,microRNA-33在胆固醇体内平衡调节中 [16] ,miR-34a在致癌性HPV感染中 [17] ,miR-92a,miR-454和miR-320b在神经发育中 [18] ,hsa-miR-106a 作为白介素-10 的调节因子 [19] , microRNA miR-122在肝脏节律基因表达中 [20] ,microRNA miR-124和 miR-135a盐皮质激素受体基因表达调节中 [21] ,MIRN125B在共济失调毛细血管扩张的发病机制中 [22] ,microRNA -125b 作为p53 的调节因子 [23] , miR-126 在血管生成中 [24] ,microRNA 155 在调控T细胞中 [25] ,miR-155在 F. novicida 感染中 [26] , miR-155 在血管紧张素II的1型受体调节中 [27] ,miR-181a在骨髓细胞中 [28] ,miR-183在细胞凋亡中 [29] , microRNA-192 in 糖尿病性肾小球中 [30] ,microRNA-206 在肌萎缩侧索硬化过程中 [31] ,miR-221在肝脏肿瘤发生中 [32] ,miR-375 在胰腺的α和β细胞中 [33] ,miR-499在肌肉中 [34] ,以及lin-4lin-14在秀丽隐杆线的营养剥夺中 [35] 。

其他几篇文章则讨论了microRNA的生物起源、全局调控或其他与microRNA相关的过程,如DGCR8功能 [36] ,Dicer [37] ,Ago2 [38] ,细胞与细胞接触 [39] ,和 Ago1 [38] ,2型糖尿病中全局的microRNA变化 [40] ,癌细胞鉴定 [41] ,传代的不稳定性 [42] ,人工microRNA [43] ,以及抑制癌细胞的microRNA合成 [44] 。 其中一篇文章还包含了piRNAs [45] 。

试剂类型
microRNA前体和成熟的microRNA

Ambion 公司的miR-34a microRNA前体和阴性对照通过转染以模拟体内的成熟miR-34a ,来揭示人乳头瘤病毒(HPV)感染可通过病毒癌蛋白E6干扰有肿瘤抑制作用的miR-34a的表达 [17] 。 Ambion的 miR-16 用来通过钨小珠轰击转染细胞进行功能获得性突变实验,以研究miR-16在识别羟色胺转运体和选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(SSRI)抗抑郁潜在活性中的作用 [7] ,Ambion的 miR-125b 二倍体用于荧光素酶报告实验用以证明miR-125b,这一脑部富集的microRNA,是一种斑马鱼和人类p53的负调控元件 [23] 。

System Biosciences公司的人hsa-mir-31microRNA表达质粒和它的控制质粒用于在细胞系中表达人 hsa-mir-31microRNA,从而用来研究 K15M 蛋白在细胞迁移和侵袭中调控microRNA表达的作用 [8] 。

microRNA mimics

MicroRNA mimics是一种修饰的小的双链RNA分子,可用于转染培养细胞或动物,与内源的 microRNA 分子具有类似的作用。

Dharmacon RNAi Technologies公司的人microRNA miR-142(3p),miR-146a和 miR-141 mimics用于通过某些特定转录翻译合成调节回路识别特定的癌细胞 [41] ,miR-33 mimics 转染入巨噬细胞中用来研究内含子miRNA miR-33在胆固醇代谢中的作用 [46] , miR-27a和miR-451 mimics用于研究microRNA miR-27a和miR-451对人癌细胞MDR1/P-糖蛋白表达调控的作用 [11] 。 Ambion公司的miRNA mimic寡核苷酸(miR-18a,miR-19a和 miRNA 负调控。 MicroRNA mimics通过Ambion pMIR-TK载体转染进细胞中 [9] 。

microRNA抑制剂

MicroRNA抑制剂能够阻断内源性microRNA的活性,因此已被广泛用于研究特定microRNA 分子的功能。

Dharmacon 公司的人miR-21和miR-31的发卡抑制剂被用于研究K15M蛋白在细胞迁徙和侵袭中调节microRNA表达的作用 [8] ,Dharmacon公司的miR-33抑制剂用于转染巨噬细胞来研究内含子miRNA miR-33在调控胆固醇代谢中的功能 [46] ,miR-27a和miR-451抑制剂被用于研究它们在对人癌细胞MDR1/P-糖蛋白表达调控的作用 [11] 。

Ambion公司的抗miR-16抑制剂被用于进行功能缺失实验,以研究miR-16在识别羟色胺转运体和选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(SSRI)抗抑郁潜在活性中的作用 [7] ,而它的抗miR miRNA抑制剂被用于转染实验,以研究 p100 和AT1R 3'-非翻译区的相互作用 [27] ,Ambion公司的miRNA反义寡核苷酸miR-125b用于荧光素酶报告实验来证明miR-125b,这一在大脑中富集的microRNA,是一种斑马鱼和人类p53的负调控元件 [23] 。 Exiqon LNA的敲除寡核苷酸 (LNA-scramble; LNA-18a; and LNA-19a) 被用于转染实验 [9] 。 Ambion siPORT NeoFX 转染试剂将microRNA 表达质粒转染进Kelly 细胞中 [9, 17] 。

RNA 提纯

大部分microRNA研究方法如Northern blot,茎环RT-PCR,微阵列分析和测序都需要纯化的RNA或者富集的小分子RNA样品。

重要提示:常用的RNA提纯试剂TRIzol会选择性地丢失去低GC结构的短RNA [47] 。明智的做法是在小RNA的净化时避免使用TRIzol。

Invitrogen公司的Trizol被广泛的用于RNA提取 [11, 17, 31, 46] 。 Invitrogen公司的 PureLink miRNA 提取试剂盒可用于纯化miRNA进行qPCR 分析 [22] 。Ambion公司的mirVana miRNA分离试剂盒能够富集小分子RNA,已被用于准备microRNA微阵列分析 [1, 5, 9, 18] ,测序 [38] ,qPCR分析 [4, 21, 27] 以及小RNA文库构建 [42] 。SABiosciences 公司的RT qPCR-级别的miRNA提取试剂盒被用于纯化microRNA进行微阵列分析 [46] 。

Ambion flashPAGE分馏器被用于获取低于40个核苷酸的小片段RNA分子,这些小片段RNA在用于微阵列分析前不包含前体miRNA分子 [5] 。

PCR

microRNA 样品进行PCR分析时必须要考虑的一个方面是内参问题。MiRNA 定量PCR结果通常利用U6 snRNA内参 [4, 25, 33] 。U6 snRNA (非编码小核RNA) 是一个剪切体用于对mRNA前体的剪切加工。U6 snRNA的水平可通过商品化试剂盒如Applied Biosystems ABI miRNA U6分析试剂盒进行评估 [33] 。 GAPDH mRNA水平有时候也会用来做对照 [31] ],5S rRNA作为 loading对照 [27] ,另外还包括肌动蛋白mRNA [35] 。

ABI公司供应miRNA特异性的茎环结构引物 [9] 。

Applied Biosystems TaqMan miRNA分析试剂盒被用于real time PCR中来研究两种新/旧肌球蛋白在哺乳动物骨骼肌中的表达:MYH14/7b和MYH15在眼外肌和肌梭中的表达 [34] ,Applied Biosystems Early Access Taqman qRT-PCR miRNA板被用来研究ATM基因突变对一些miRNAs的影响 [22] 。Ambion mirVana qRT PCR miRNA检测试剂盒用于检测分离的RNA来研究p100和AT1R 3-UTR 相互作用对AT1R表达的影响 [27] 。Invitrogen NCode miRNA First-Strand cDNA试剂盒被用来获取第一链互补DNA来研究foxp3依赖的microRNA155 在维持T细胞的竞争性状态 [25] 。

GenePharma Hairpin-it miRNAs qPCR Quantitation Assay也有使用 [4] 。

Northern blot

杂交缓冲液包括Ambion ULTRAhyb-Oligo缓冲液 [9] 和Sigma PerfectHyb Plus杂交缓冲液 [17] 。

Ambion 尼龙膜 [9] 和PerkinElmer GeneScreen Plus 杂交转移膜 [17] ,Amersham Hybond 膜 [7] 被使用。

Northern blot探针利用gamma-32P-ATP (Amersham Biosciences) 进行标记,标记可使用 T4 多核苷酸激酶 (New England Biolabs) [7] , IDT Starfire 标记试剂盒 [31] 或者Stratagene Prime-It II 随机引物标记试剂盒 [35] 。

U6 [7, 31] 和秀丽隐杆线虫5.8S rRNA [35] 被用于作为Northern blot对照。

原位杂交

关于microRNA 研究的文章中涉及到原位杂交的不多。Exiqon 特异性锁定核酸的探针通过Roches 公司的末端转移酶和DIG-ddUTP标记进行原位杂交分析 [33] 。

microRNA 微阵列

Applied Biosystems TaqMan microRNA 反转录试剂盒 [1] ,或者SABiosciences RT2 miRNA First Strand kit [46] 被用来进行反转录。Ambion mirVana miRNA Probe Set version 1,mirVana miRNA 标记试剂盒和mirVana miRNA Bioarray Essentials Kit被用于进行微阵列分析,来研究microRNAs 在脊椎动物内耳毛细胞发育和功能中的作用 [5] 。

Agilent miRNA labeling Reagent & Hybridization Kit 被用于与Agilent Mouse miRNA微阵列杂交前,对小分子RNA进行标记 [37] ,Agilent Human microRNA Microarray (v3) 被用于检测microRNA 在14个人体、11个黑猩猩和8个猕猴中的表达情况 [18] 。SABiosciences Human Whole Genome miRNA Array set 被用于进行miRNA 微阵列分析 [46] 。

小分子RNA测序

Illumina Genome Analyzer II 被用于进行小分子RNA测序分析,来研究果蝇小的沉默RNA中microRNA*链的作用 [38] 。

杂项

Invitrogen pDONR207被用于将人工合成的microRNA前体连接到miR319a骨架来表明转录因子KNOTTED1 能够通过分子伴侣在细胞间转运 [43] 。

试剂供应商

miRNA研究试剂主要由几个供应商提供,总结在表三中。

Life Technologies Corporation 公司并购了几家供应miRNA研究试剂的公司,品牌包括Invitrogen,Applied Biosystems (ABI),Ambion和Taqman.

试剂方法参考文献
Life Technologies公司
Invitrogen TRIzol试剂RNA提取 [11, 17, 31, 46]
Ambion mirVana提取试剂盒miRNA提取 [1, 4, 5, 21, 27, 38, 42, 45]
Ambion flashPAGE FractionatormiRNA纯化 [5]
Invitrogen PureLink miRNA提取试剂盒miRNA 纯化 [22]
Ambion miRNA,miRNA mimic,和对照 [7, 9, 17]
Ambion miRNA抑制剂和对照 [7, 23, 27]
Ambion siPORT NeoFX转染试剂 miRNA转染 [9, 17]
Ambion mirVana qRT PCR miRNA 检测试剂盒 PCR [27]
Applied Biosystems miRNA特异性茎环结构引物 PCR [9]
Applied Biosystems TaqMan microRNA 反转录试剂盒 PCR [1]
Applied Biosystems TaqMan miRNA分析试剂盒 PCR [34]
Applied Biosystems Early Access Taqman qRT-PCR miRNA panel PCR [22]
Invitrogen NCode miRNA First-Strand cDNA KitPCR [25]
Applied Biosystems ABI miRNA U6 assay kit PCR 对照 [33]
Ambion Nylon Membrane Northern blot [9]
Ambion ULTRAhyb-Oligo buffer Northern blot [9]
Thermo Fisher Scientific。 注意:Dharmacon现是GE Healthcare。
Dharmacon miRNA,miRNA 模仿剂和对照 [11, 41, 46]
Dharmacon miRNA inhibitor and control [8, 46]
其他供应商
Agilent 人和小鼠miRNA微阵列微阵列 [18, 37]
Agilent miRNA标记试剂&杂交试剂盒Northern blot [37]
SABiosciences RT2 miRNA第一链试剂盒 PCR [46]
SABiosciences 人全基因组 miRNA芯片 芯片 [46]
GenePharma Hairpin-it miRNAs qPCR 定量试剂盒 PCR [4]
System Biosciences miRNA 和对照 [8]
Amersham Biosciences gamma-32P-ATP Northern blot [7]
Amersham Hybond膜Northern blot [7]
Illumina Genome Analyzer II测序 [38]
IDT Starfire 标签试剂盒 Northern blot [31]
PerkinElmer GeneScreen Plus杂交转移膜 Northern blot [17]
Roche 末端转移酶和DIG-ddUTP Northern blot [33]
Sigma PerfectHyb Plus杂交缓冲液 Northern blot [17]
Stratagene Prime-It II随机引物标记试剂盒 Northern blot [35]
Exiqon 锁核酸探针原位杂交 [33]
表三: microRNA研究的重要试剂供应商。
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