基于切刻内切酶构建钾离子适体传感器
Xiaoli Zhu (xiaolizhu at shu dot edu dot cn), Genxi Li (genxili at nju dot edu dot cn)
Laboratory of Biosensing Technology, School of Life Sciences, Shanghai University, Shanghai 200444, P. R. China
译者
王秀英 (mary at labome dot com)
美国新泽西州普林斯顿合原研究有限责任公司 (Synatom Research)
DOI
http://dx.doi.org/10.13070/mm.cn.1.67
日期
更新 : 2014-10-05; 原始版 : 2011-05-19
引用
实验材料和方法 2011;1:67

自1990年适体概念被阐述以来,适体已经被广泛地运用于生物传感器构建的研究,适体传感器这一分枝也随之孕育而生。近年来,尽管已经有许许多多的适体传感器被成功研制,然而文献所报道的大部分适体传感器仍存在着检测灵敏度较低的问题,而这一问题很大程度上要归咎于缺乏合适的信号放大机制。由于适体传感器本身的特异性,很难在构建适体传感器时设计出类似于免疫传感器中酶联免疫分析这一通用信号放大策略。最近,上海大学李根喜教授课题组构建了一种基于切刻内切酶检测钾离子的适体传感器 [1] ,该设计方案有望在今后进一步发展成为适体传感器构建工作中的一种通用的信号放大策略。

切刻内切酶是一种限制性核酸内切酶,它可以特异性地识别双链DNA中的一段核苷酸序列,并对其中的一条链进行切割。李教授等设计了一条双链 DNA, 该双链DNA含一条15个碱基的能特异性结合钾离子的适体链,以及另外一条含22个碱基的互补链。该双链DNA 同时含有Nt.CviPII这一切刻内切酶的两个限制性酶切位点(5'-(切割)CCD-3', D = G或A)。在切刻内切酶的切割下,含有22个碱基的互补链将可以被切割成为3个小片段,切割后由于较低的解链温度,这些片段在合适的温度下,会自发地和互补配对的适体链发生解聚。因此,游离出的适体链又能够和新的完整的互补链重新互补配对,形成切刻内切酶新的底物,从而被切割形成更多的小片段。由于这种链循环切割并不需要热解聚过程,因此在仅有微量适体链存在的情况下,可以形成大量的被切割的互补链片段。然而,当有钾离子存在时,适体链更倾向于与钾离子结合形成鸟嘌呤四聚体复合物而不是与其互补链进行互补配对。这导致双链DNA难以形成, 切刻内切酶不能发挥其酶切作用,因此过量的完整的互补链会在反应体系中累积。

李教授等进一步引入了基于金纳米颗粒颜色变化的检测策略,通过金纳米颗粒的颜色变化来定量分析上述体系中的互补链。当互补链被切割成片段时,将不能有效地使修饰有探针DNA的金纳米颗粒发生聚集,金纳米颗粒胶体仍呈现出红色。而在钾离子存在时,互补链不被切割而保持完好,从而可以有效地连接修饰有探针DNA的金纳米颗粒,使之发生聚集,使颜色从红色转变为紫色。颜色变化的程度与体系中钾离子的浓度具有定量关系,从而可以用于钾离子的检测。

因此,该方案将钾离子的量化信息首先通过切刻内切酶转变并放大为一条DNA的量化信息,然后再对此DNA进行相应地定量分析,从而间接地实现钾离子的定量检测。在以往所构建的适体传感器中,靶物质的量化信息通常被直接转换为可检测的信号。以基于荧光共振能量转移构建的适体传感器为例,靶物质结合到两端标记有荧光基团和荧光淬灭基团的适体后,会导致适体链构象的改变以及后续的荧光基团与其淬灭基团的靠拢或者离开,从而产生可检测的荧光共振能量转移信号。由于靶物质差异性很大,既可能小到离子,又可能大到细胞,而相应的适体链有规律的构象变化通常又是未知的,因此很难将一种适体传感器策略推广用于其他靶物质的检测。然而,如果将靶物质的量化信息传递给一条核苷酸链,那么适体传感器便可以转换变为DNA传感器,许多成熟的通用的检测策略可以被应用,因此,该研究为构建用于各类分子检测的通用的适体传感器提供了一个平台。

参考文献
  1. Zhu X, Zhao J, Wu Y, Shen Z, Li G. Fabrication of a highly sensitive aptasensor for potassium with a nicking endonuclease-assisted signal amplification strategy. Anal Chem. 2011;83:4085-9 pubmed publisher
ISSN : 2329-5147