近几年，逆转录病毒和慢病毒载体已越来越成为向各种实验系统的各种细胞转运核酸的重要工具。除了在实验室的组织培养和动物模型生产中发挥重要作用，它们还被用于治疗遗传性疾病的临床试验中。使用慢病毒或逆转录病毒系统可以使目标细胞基因组获得稳定可遗传的特定核酸序列。利用慢病毒和逆转录病毒的这一特征理论上可以使基因构建体，如siRNA或蛋白编码序列在一群细胞中永久表达。

逆转录病毒科的一员，包括γ-逆转录病毒和慢病毒，特征为其RNA基因组能逆转录为cDNA副本，cDNA副本又能稳定整合至宿主细胞基因组中。逆转录病毒通常分两种：简单的（有时又称为致癌病毒或γ-逆转录病毒，如鼠白血病病毒）和复杂的（如慢病毒）。这些亚型间主要的差异在于复杂的逆转录病毒存在一些附属基因和调控基因，而简单的则没有（下文有进一步的讨论） [5] 。这两类病毒颗粒都含有两份正链RNA，RNA上附有病毒反转录酶（RT），它们位于病毒的内核（图1）。位于内核的还有结构蛋白和酶，包括核壳（NC）、衣壳（CA）、整合酶（IN）和蛋白酶（PR）。内核由一圈外周蛋白层包围，外周蛋白包括基质蛋白（MA），基质蛋白又被来源于宿主细胞细胞膜插有包膜糖蛋白的腹膜所包围 [5] 。

[放大]

图 1. 简单和复杂逆转录病毒粒子结构。病毒颗粒含有两份正链RNA，RNA上附有反转录酶（RT），它们位于病毒的内核。除此之外，内核还包含核壳（NC）、衣壳（CA）、整合酶（IN）和蛋白酶（PR）。内核由一圈基质蛋白（MA）所包围，基质蛋白又被来源于宿主细胞细胞膜插有包膜糖蛋白（ENV）的腹膜所包围。改编自 [1-3] 。

简单和复杂的逆转录病毒都含有两份线性、不分节段的、长7-12 kb的单链RNA，编码gag, pol和env基因。Gag编码一种多聚蛋白，翻译自一条无拼接的mRNA，mRNA然后被病毒蛋白酶（PR）切割成MA、CA和NC蛋白。Env基因也编码一种多聚蛋白前体，前体被细胞内的蛋白酶切割成表面包膜糖蛋白（SU）gp120和跨膜（TM）糖蛋白gp41。其中，gp120与细胞表面受体和辅助受体相互作用，gp41在病毒膜上与gp120形成gp120／gp41复合体，在病毒进入宿主细胞时催化膜融合。由于Gag mRNA翻译时发生核糖体移码，Pol表达的是Gag-Pol多聚蛋白，编码RT、PR和IN三种酶。这三种蛋白附着在病毒粒子的基因组上。RT蛋白拥有如下三种活性：（a） RNA依赖的DNA聚合酶活性，负责将两条RNA转录成一个cDNA；（b） 核糖核酸酶H活性；（c） DNA依赖的DNA聚合酶活性。PR用于切割Gag和Gag-Pol多聚蛋白，导致病毒粒子的成熟和产生具感染能力的病毒粒子。IN负责将病毒的cDNA整合至宿主细胞基因组中。一旦整合完毕，病毒基因组便与宿主细胞染色体相连，称为前病毒 [1, 5, 6] 。

复杂的逆转录病毒基因组区别于简单的逆转录病毒基因组的地方主要在于前者存在一套附属基因，其产物涉及到转录调控、RNA转运、基因表达与装配。其中包括Rev和Tat蛋白以及Vpu、Vif、Vpr和Nef这些附属蛋白。Rev是一种RNA结合蛋白，保证晚期基因的表达。它还对未拼接的和单股拼接的mRNA的转运来讲非常重要，它编码从核到细胞质的病毒结构蛋白。Tat是一种RNA结合蛋白，起到增强转录的作用。Nef蛋白抑制T细胞激活。Vpu能增强病毒进入过程中从细胞表面到细胞质中的释放 [5] 。Vif蛋白是慢病毒复制所必须的，因为它能下调宿主的抗病毒反应 [5, 7] 。

整合后的前病毒基因组（图2）在5'和3'端分别有长末端重复序列（LTR），LTR分别由以下三部分构成：（a） U3区域，它作为启动子含有转录增强元件和一个TATA盒；（b） R区域，转录起始部位；（c） U5区域，涉及反转录，带有一个tRNA引物结合位点。前病毒中的其他重要序列元件包括包装信号（ψ, psi）和多嘌呤管道（ppt），后者是逆转录过程中正链DNA起始合成的位点 [5, 6] 。

[放大]

图 2. 复杂逆转录病毒基因组的结构。逆转录病毒的单链RNA呈线性，不分节段，长7-12 kb，编码gag、pol和env基因。Gag基因编码一种多聚蛋白，翻译自一条无拼接的mRNA，mRNA然后被病毒蛋白酶（PR）切割成MA、CA和NC蛋白。Env基因也编码一种多聚蛋白前体，前体被切割成表面包膜糖蛋白（SU）gp120和跨膜（TM）糖蛋白gp41。Pol基因表达为Gag-Pol多聚蛋白，编码RT、PR和IN酶。这三种蛋白附着在病毒粒子中的病毒基因上。不像简单的逆转录病毒，复杂的逆转录病毒编码一系列附属蛋白包括Vpu、Vif、Vpr和Nef。整合后的前病毒基因组有5'和3'两个长末端重复序列（LTR），LTR包括U3、R和U5区域。最后，psi （ψ）序列作为RNA基因组的包装信号。改编自 [1, 2] 。

尽管简单和复杂逆转录病毒的基因组有差别，但其复制周期非常相似（图3）。感染始于包膜糖蛋白gp120与细胞表面受体结合，导致ENV构象改变，暴露跨膜亚单位，致使病毒粒子的被膜和细胞膜融合，接下来病毒核心释放入细胞质。病毒嗜性由病毒包膜糖蛋白gp120识别特定细胞表面受体的能力决定 [6] 。例如，HIV和SIV与辅助受体（通常为CXCR4或CCR5）相互作用后，能识别巨噬细胞和TH细胞表面的CD4受体 [1, 6] 。此时，RNA基因依然存在于病毒内核中，在RT的介导下被逆转录为双链DNA [1, 2, 8] 。

值得注意的是，这是慢病毒的复制周期不同于简单的逆转录病毒的时刻。简单的逆转录病毒的双链DNA不能够通过核孔复合物，只有有丝分裂核膜消失后cDNA的整合才能发生 [5] 。而慢病毒感染时，预整合复合体即可转运至核内，因此慢病毒在分裂和不分裂的细胞中都能进行整合 [9] 。这是一个重要的特征，在选择适当的载体进行特定的用途时需要考虑，因为逆转录病毒载体在不分裂的细胞中无法有效整合外来基因。

[放大]

图 3. 逆转录病毒的复制。感染始于病毒的Env蛋白与细胞表面受体相互作用，然后进入细胞。RNA基因组由RT反转录为双链DNA，然后入核，在IN的作用下整合至宿主基因组内。新合成的病毒蛋白和病毒基因组RNA积累一段时间后，这些组成部分被包装成一个个病毒颗粒，以出芽的方式离开细胞，获得了一层来源于细胞的膜。当Gag和Gag-Pol多聚蛋白被病毒蛋白酶切割后，病毒颗粒成熟。图改编自 [1, 2, 4]

整合由IN酶介导。这个过程始于移去两条cDNA 3'端的几个核苷酸。IN会切开细胞的DNA，病毒的cDNA便与突出的一端相连接。单链缝隙由细胞的DNA修复机器填补 [1] 。整合后的病毒DNA被称为“前病毒”并与宿主染色体一同复制和遗传。曾经有很长一段时间，人们认为整合不以序列特异的方式进行 [6] 。然而，一项早期研究显示非随机整合的迹象，这是在一次X-SCID基因治疗时偶然发现的，当时基于MLV的治疗载体在众多受试患者中选择性地整合到了原癌基因附近的位点上。这似乎是一些受试患者产生白血病的主要原因，引发了对逆转录病毒插入的突变副作用的担忧。自全基因组测序后，最近的研究提示，病毒的特异整合模式事实上可能依赖于染色质结构而不是DNA序列。例如，最近研究表明当目标染色质固缩时HIV-1 cDNA的整合受阻 [10] 。另一方面，观察到考虑目标染色质后，鸟肉瘤病毒（ASV）实际上能更有效地进行整合。同样，对于HIV-1、HIV-2、基于HIV-1的载体、基于猴免疫缺陷病毒（SIV）的载体和猫免疫缺陷病毒，大约79%的整合事件发生在基因内 [10] 。慢病毒载体似乎对整合位点有偏好，整合位点多为远离转录起始点的位点 [8, 11] 。相反，MLV（一种γ-逆转录病毒）大约20%的感染事件发生在转录单位的5'端，对CpG岛和DNase I超敏感位点附近有一定的倾向性。有意思的是，HIV-1、SIV、MLV和ASLV似乎对整合位点附近的碱基有对称的倾向性 [10, 12] 。更让我们对前病毒整合位点的选择性产生困惑的是宿主细胞的复杂贡献，不同的待考察的逆转录病毒和感染的细胞类型中宿主细胞的贡献都不相同 [10] 。整合位点的偏好会对各种慢病毒或γ-逆转录病毒载体的基因毒性水平产生有趣的影响。显而易见，与逆转录病毒载体相比，慢病毒载体似乎致癌可能性较低 [8, 11] 。

整合后的病毒cDNA在位于病毒5'端的LTR的启动子／增强子作用下通过细胞的转录机器进行转录 [13] 。转录本从核中转运出来，与细胞的mRNA一起翻译 [13] 。早期的转录本编码Rev、Nef和Tat蛋白，Tat和Nef都含有内含子，在成熟的mRNA中被除去 [6] 。Tat与位于5'LTR的反式激活反应元件结合，刺激更长的转录本的转录 [11] 。Rev与新转录的病毒mRNA的内含子结合。Tat和Rev的积累导致转录向晚期进行，期间含有一个或两个内含子的mRNA被翻译。这些更长的转录本编码结构蛋白 [6] 。

在细胞质内，两套附有复制酶的病毒RNA遗传物质被核心蛋白所包围，形成了病毒衣壳。随着它向细胞表面迁移，Gag和Gag-Pol多聚蛋白被病毒蛋白酶切割，形成一个成熟的能够感染的病毒颗粒 [6, 11] 。成熟的病毒颗粒于是通过出芽的方式离开细胞膜，从而获得了它的包膜 [5] 。

近来，几个实验室都构造出了不通过传统的逆转录机制进行整合或者根本无需整合的慢病毒。后者，称为整合缺陷的慢病毒载体，含有一个突变的IN，因此其IN酶无活性。这些慢病毒载体在宿主细胞的细胞核内产生双链的游离DNA环。开发整合缺陷的慢病毒载体部分原因是对随机整合和插入后生成肿瘤的担忧（如上文所述） [12] 。另外，还存在慢病毒载体-转座子杂合体，它通过转座产生稳定整合的转基因。最后，还有通过同源重组插入外源基因的慢病毒载体。它的优点是减小了插入突变的可能性并保持了“替换”序列天然的表达模式 [12] 。

慢病毒和逆转录病毒载体技术的另一大进步是在动物和人体上的应用。原代细胞可以通过慢病毒或逆转录病毒载体（如引入gfp转染的癌细胞或肝细胞）进行转基因，然后导入小鼠体内。接下来可以使用各种各样的成像技术跟踪细胞 [11] 。由于慢病毒载体转运基因的高效性、转基因表达的耐用性、提高了很多不同动物种类的存活率，它也可代替质粒DNA注入受精卵的方法来生产转基因动物 [11, 14, 15] 。慢病毒载体在医学中的应用也显示出希望。然而，对安全性和遗传毒性方面的顾虑已成为阻碍病毒载体广泛用于治疗的主要原因。另外还有生产上的挑战，如保证纯度和高产，这是对临床级的慢病毒载体的要求。自使用基于腺病毒载体、γ-逆转录病毒载体或腺相关病毒载体的基因疗法后，已有数起死亡案例。如上文所述，尽管使用逆转录病毒载体治疗X-SCID是一次成功的试验，但是很多患者最终死于白血病，这是由于转基因的插入突变造成的。为了让这些载体更安全、在临床试验中更有用，人们还在继续努力。例如，最近使用慢病毒载体转染的造血干细胞成功地在动物模型中校正了镰状细胞贫血病 [16] 。有趣的是，最近一项很有希望的研究表明源于HIV的载体的基因疗法很可能对战胜HIV感染本身非常有用 [17, 18] 。

处理基于慢病毒和γ-逆转录病毒的载体时应特别小心，因为他们通常来源于人病原体。操作这些载体时主要的隐患在于（a）产生能自我复制的有感染能力的慢病毒；（b）肿瘤生成的潜在可能性；（c）转基因的潜在毒性。第二和第三代慢病毒系统作为主要的可获得的商品化的慢病毒系统采取了很多安全措施降低了这些风险 [19] 。在这些系统中，包装蛋白和酶用不同的载体表达，减少了包装构建体之间的同源性，因此降低了同源重组的可能性。此外，由于剔除了3'LTR，很多慢病毒转运载体是自身无活性的 [20] 。

• 穿着适当的个人防护设备（即实验服和手套；一些公司建议带两双手套）
• 在二级洁净层流柜内操作
• 所有的工作台表面都要进行消毒（尤其是溢出、溅出或产生气溶胶后）
• 采用二级生物安全柜或增强型二级生物安全柜
• 关于处理慢病毒和逆转录病毒的更多信息和实验室生物安全水平标准，请询问NIH和美国疾病控制与预防中心健康和安全办公室。

慢病毒和逆转录病毒基因递送系统利用了逆转录病毒复制方面的性质以获得目标核酸序列稳定的整合。核酸转染只能获得瞬时的转基因表达，而基于逆转录病毒和慢病毒的系统却可以获得外源基因稳定的整合，外源基因于是被遗传下去随重复的细胞分裂持续表达。慢病毒和逆转录病毒载体的一个重要特征是他们产生的是复制有缺陷的，即自身无活性的病毒颗粒。这使得目标序列得以转运，而在目标细胞中不存在连续的病毒复制。更重要的是，因为它们中的一些是人源病毒，这免去了使用活的病原体所伴随而来的危险。复制缺陷的病毒是通过反式互补的方式生产的（图4），其中包装细胞与三种不同的质粒（见下文）共转染（图5），它们一起表达产生有感染能力的病毒颗粒所需的全部蛋白，并带有递送所需的目标核酸序列。尽管很多慢病毒载体系统基于转运两个辅助质粒（第二代）和转运质粒，一些更新的系统（第三代）则将包装和包膜构建在三个质粒上再与转运质粒结合。用于构造复制缺陷的逆转录病毒或慢病毒的典型的转运质粒和两个辅助质粒如下文所述：

[放大]

图 4. 制作慢病毒和逆转录病毒载体。慢病毒载体（左边）的生产：将一个包装细胞系（293T／293FT）与表达cDNA／shRNA的转运质粒、两个辅助／包装质粒共转染，辅助／包装质粒编码结构和包膜（通常为VSV-G）蛋白。包装细胞产生有感染能力的颗粒，其基因组仅编码来自于转运质粒的序列，这可用于转染目标细胞。逆转录病毒载体（右边）的生产：与慢病毒生产类似，主要的差异在于第一步只转染一个质粒。只将转运质粒转入包装细胞系（Phoenix），包装细胞系内已有辅助构建体。改编自。

该质粒用于将目标基因递送至靶细胞。U3区域和其他3'LTR转录活性序列被切除，这导致它成为一个自身无活性的LTR（这样的LTR被认为比完整的／有活性的LTR更安全，因为后者能够激活插入位置附近的基因）。5'LTR驱动包装基因RNA的表达，该转基因由载体内的启动子驱动 [11] 。

Gag和Pol：这些病毒蛋白是病毒粒子的成熟所需要的。Tat和Rev上调转录活性和核转运RNA基因组。这些附属基因已被剔除以减少重组发生的可能性和增加安全性（见下文安全性一节） [11] 。在新一代的慢病毒系统中，Tat已被剔除，Rev被置于一个单独的载体上以增加安全性。

病毒载体可以借助其他病原体的外壳蛋白包装成假病毒，以改变其嗜性。最常用的是疱疹性口腔炎病毒膜融合包膜G糖蛋白（VSV-G） [21] 。其他常见的包膜蛋白来源于狂犬病毒、鼠白血病病毒、埃博拉病毒、杆状病毒、麻疹病毒和纤丝病毒。杆状病毒GP64和肝炎E1和E2型假病毒增强肝转导，纤丝病毒包膜型假病毒增强呼吸道上皮细胞或内皮细胞的转导。有趣的是，假病毒还会影响狂犬病毒糖蛋白包被的慢病毒的运输，导致轴突逆行运输 [12] 。

注意：由于γ-逆转录病毒和慢病毒gag、pol和env基因间的亚型差异，转运质粒和包装质粒不能够互换。

[放大]

图 5. 慢病毒质粒。很多的慢病毒系统使用一个转运质粒和两个辅助质粒。它们的特征在文中已有详尽的描述。更新的系统也许会使用三个辅助质粒，其中rev基因编码在一个单独的质粒上。通过进一步阻止重组事件的发生，阻止能自我复制的病毒的产生，这被认为能改进安全性。

在程序上，慢病毒和逆转录病毒载体的一个重要区别在于：对慢病毒载体，通常包装、包膜和转运质粒共转染入包装细胞系，而对逆转录病毒载体，只有转运载体才转染到细胞系内，而细胞系早已稳定表达另外两种载体。对逆转录病毒而言，转运载体被转染至Phoenix细胞内，Phoenix细胞是带有两个辅助构建体（env和gag-pol）作为附加体的人胚肾293T细胞。这些细胞只有在转染了转运载体后才能产生逆转录病毒（图4，右）。Phoenix细胞需经过每3个月的潮霉素B和每周的白喉毒素的双重选择，以确保所有细胞中这两个辅助构建体都存在。Phoenix-Eco细胞和Phoenix-Ampho细胞可通过Invitrogen和Gentaur获得。

通常，人胚肾293T细胞或293FT细胞作为慢病毒的包装系。293FT细胞专门被设计成用于生产高滴度的慢病毒。事实证明慢病毒载体的包装细胞系更难获得，因为很难克服蛋白酶（由pol基因编码）和VSV-G的毒性 [12] 。现已开发出几种逆转录病毒和慢病毒生产系统且已被商品化（参看产品一节）。

选择转运质粒时，需要关注驱动目标基因的启动子。RNA聚合酶II启动子（如CMV）驱动编码蛋白质的RNA的表达。RNA聚合酶III启动子（如H1或U6）驱动更短的转录本的表达，如shRNA。

• 慢病毒载体生产的第一步是将转运质粒、包膜质粒和gag-pol质粒与包装细胞共转染（如果是逆转录病毒载体生产则为单次转染转运质粒）。
  注意：包装细胞不能汇合，因为这会降低其转染效率。
  质粒DNA质量也会影响转染效率。使用商品化试剂盒，如QIAGEN的Endotoxin-free Plasmid Kit能帮助解决质粒质量上的问题。
• 源于HEK293T的细胞在磷酸钙或脂质体的介导下是高度可转染的（参看产品一节）。根据所使用的转染方法，添加新鲜培养基12－18小时后，可能需要冲洗细胞。转染大约24小时后，应除去培养基，用目标细胞的培养基替代。接下来48-72小时用于让包装细胞生产病毒。因为慢病毒在32 °C下比37 °C下更稳定，可以将包装细胞在此温度下培养直至收获病毒。

• 病毒浓度达到最大值的时间通常是在培养后48-72小时。为了收集病毒，除去包装细胞上清液，并将其置于15 mL的离心管中。为了除去细胞碎片，可以将上清液在1500 rpm下离心5分钟或用0.45 um的滤纸过滤。
  注意：纯化的病毒可以保存在-80 °C备用。但是，每次冻融都会使滴度降低50%。
• 如果需要更多的病毒，可以向包装细胞中重新添加培养基，并在转染后96小时再次收获。
  注意：如果有需要，病毒的滴度可以用多种方法来测定，如下文所述。

• 现在可以将含有病毒的培养基加入次融合的目标细胞中去了。活性分裂的细胞能更有效地整合病毒；对于逆转录病毒载体，细胞必须处于不断的分裂中否则构建体无法进入核内。根据你的实验，你可以选择一个特定的感染复数（MOI）或者你可以对一系列体积的纯化病毒进行测量以确定哪一个最适合。
• 添加聚凝胺（SantaCruz sc-134220; Millipore TR-1003-G; Sigma 107689）可以增强慢病毒和逆转录病毒的转染效率。聚凝胺又称海地美溴铵，这种阳离子聚合物用于增强逆转录病毒转染的效率。它被认为是通过中和病毒－细胞之间的静电排斥力 [22] 和增强受体不依赖的病毒的吸收 [23] 来起作用的。
  次日更换培养基
  注意：如果慢病毒颗粒的毒性是一大隐患可以每4小时即更换一次培养基。
  注意：构建体的反转录和整合发生在24-36小时内。
  如果有需要的话，可以重复转导过程。当含有病毒的培养基从包装细胞中除去后，换上新鲜的培养基。新鲜的培养基可在24小时后再收集，这样就重复了转导的步骤了。

• 有些转运载体还含有标记，如荧光报告蛋白或药物筛选标记。
• 荧光激活细胞分选术可被用于富集表达荧光标记（如GFP）的细胞。
• 如果细胞含有药物筛选标记，则依照那种药物的实验方案来进行筛选。例如，嘌呤霉素筛选的浓度通常为1-10 ug／mL，这主要取决于目标细胞的敏感度。

因为生产和应用慢病毒和逆转录病毒载体需要很多步骤，所以很多地方都会影响生产或转导的效率。在此我们将讨论一些最常见的问题：

一种可能的原因是包装细胞相互融合，这将导致病毒的生产在短期内减少。考虑解冻一批新的细胞。或者，如果是逆转录病毒，可能需要对Phoenix细胞进行潮霉素B和白喉毒素双重筛选以确保所有的细胞都表达两个包装构建体。

对于你特定的系统，转运质粒和辅助质粒的比例可能需要优化。很多公司会建议一个起始比例，但这需要重新调整。

尽管慢病毒和逆转录病毒相对而言比其他病毒载体系统能容纳更大的插入序列，但包装还是有限度的。病毒颗粒可以在两个LTR之间容纳8-10 kb的片段。长于8-10 kb的转基因构建体会大大降低包装的效率，这将导致病毒滴度变低。

另一种克服滴度低的可能的方法是浓缩病毒。纯化除去细胞碎片后，上清液可通过超滤被压制成颗粒。用培养基或缓冲液重新悬浮颗粒至所需体积。很多公司提供浓缩病毒的产品和试剂（参看产品一节）。

如果病毒滴度已经很高了但是转导细胞产量还是低，很可能转导的培养基的体积对目标细胞而言太高了 [24] 。转导这一步所需的培养基体积是可以刚好覆盖细胞的量，这能增加病毒对细胞的暴露水平，使病毒－细胞之间的相互作用最大化。应注意培养皿表面不能干涸，转导时应周期性地摇动培养皿或采取其他办法。4-6小时后可以增加培养基体积以防止过夜时细胞干死。

也有可能是过早地收集了病毒。病毒生产的高峰期是在转染后48-72小时。

有些细胞，如原代成纤维细胞或神经细胞，确实很难转导。这可能是一个很难解决的问题，可能需要优化转导实验方案或用更高的滴度进行转导。另一种可以考虑的方法是用假病毒，假病毒可以结合更多特定细胞上的受体。

包装细胞培养基可能与目标细胞生长所需培养基不相适应。或者用目标细胞所需的培养基重新稀释病毒或者如上文所述浓缩病毒然后用目标细胞所需培养基重新悬浮病毒。

有很多不同的公司提供生产慢病毒和逆转录病毒载体的试剂。在选择试剂时，需要考虑以下几个问题：

• 你要克隆的基因片段有多难？
• 你的目标细胞很难转导吗？
• 你需要高的病毒滴度吗？
• 你需要表达什么类型的片段？

很多试剂和质粒都为了特定的目的（生产高滴度的病毒）优化过或设计成特定的特征（如特异性启动子、双启动子或诱导型启动子）。

现有几种基于HEK-293的包装细胞（如上文所述）变种，可通过商业途径获得：

转染试剂可以通过商业途径获得或者在实验室中配制。除了最常用的转染试剂（lipofectamine、fugene、磷酸钙等），还有很多商品化的试剂盒，含有转运和辅助质粒，有更高的病毒产量和优化了的质粒比。

Lipofectamine是一种阳离子脂质体有一个带正电荷的头和1-2条碳链。头部与核酸的磷酸骨架相互作用。脂质体表面的正电荷使得脂质体/核酸复合物能与带负电荷的细胞相融合。

Fugene是一种非脂质体转染试剂，但依然拥有高的转染效率和低的毒性。它与血清兼容，使用后无需更换培养基。它由专利配方的正电荷脂质体和其他成分组成，转染试剂与带负电荷的DNA相互作用，帮助其进入细胞内。

注意：当结合Fugene和质粒时，建议使用聚苯乙烯管，Fugene最后添加以避免与管子相互作用。

Roche将其描述为“一种多成分的试剂，与DNA形成复合物，然后将复合物转运至动物或昆虫细胞”。它能够将DNA转染至各种各样的细胞，而将毒性降到最低。

转运质粒来源于各种各样的骨架。典型的载体都含有下列部分或全部特点，这些特点使得载体更安全，增加病毒的滴度，或者增加插入物的表达水平。

Sigma-Aldrich为其MISSION shRNA质粒提供了很多骨架。有许多荧光、药物标记或诱导系统可选。shRNA载体使用的是U6启动子。它们提供所有骨架的阳性对照和阴性对照。这是与RNA团体科学家合作共同开发的，基于pLKO.1-puro的载体是博德研究所开发的 [25] 。所有这些都是慢病毒载体。已有超过1500篇发表的期刊文献使用了各种各样的MISSION shRNA质粒。

SBI提供基于HIV和FIV的慢病毒载体，其载体有很多启动子，取决于要转导的细胞类型：CMV（巨细胞病毒）用于HeLa及其他多种细胞；HEK293和HT1080转导；MSCV（小鼠干细胞病毒）用于造血细胞和干细胞转导；UbC（泛素C）用于转导大部分类型的细胞；PGK（磷酸甘油酸激酶）用于转导大部分类型的细胞；EF1（延伸因子1α）用于转导大部分类型的细胞。除了下面所列的转运载体，他们还提供诱导型和双启动子骨架。已有的选择性标记包括GFP、RFP、嘌呤霉素、潮霉素、新霉素和Zeocin。

他们家的骨架－启动子和标记总结如下。

Invitrogen提供ViraPower慢病毒表达系统。转运质粒是基于pLP或pLenti的载体，并带有三个包装/辅助质粒（pLP1，pLP2和pLP/VSVG）。他们家有在CMV、UbC、CMV/TO、RSV或EF-1α启动子驱动下的优化了基因表达的慢病毒系统。他们有几种慢病毒载体用于生产Lumio或V5表位标记的蛋白。Invitrogen系统的一个与众不同的特点是他们提供多种克隆选择，包括Gateway （DEST™），TOPO®，和基于重组的（pLenti6/UbC/V5-DEST）系统。各种各样的基于pLenti的质粒已发表在2000多篇期刊文章上。

生产逆转录病毒

Cell Biolabs提供一系列逆转录病毒表达载体，他们结合在各种基于鼠白血病病毒（MLV）的背景质粒中。他们提供逆转录病毒包装细胞系（293RTV）和病毒纯化浓缩试剂盒（ViraBind浓缩和纯化试剂盒或ViraBind PLUS浓缩和纯化试剂盒）。实验表明他们的pMXs、pMYs和pMCs载体对诱导多能干细胞起效。他们提供几种筛选标记：潮霉素、新霉素、嘌呤霉素、Zeomycin和GFP。各种各样的骨架载体已发表在500多篇期刊文章上。

生产慢病毒

Cell Biolabs, Inc.提供基于pSMPUW-IRES和pSMPUW-U6的慢病毒表达载体，其中目标基因能直接被克隆。他们有下列筛选标记：灭瘟素、潮霉素、新霉素、嘌呤霉素和GFP。这些转运载体带有卡那霉素抗性基因、WPRE、多克隆位点（MCS）、cPPT、3'LTR和5'CMV/LTR。这些表达载体已发表在6篇期刊文章上。

Addgene是一个非盈利的质粒保存中心，提供各种各样的慢病毒和逆转录病毒转运载体。一些常用的逆转录病毒载体列在下表中：

可从Addgene获得的常用慢病毒载体包括：

Cell Biolabs, Inc.提供基于柱子、透析或过滤的慢病毒浓缩和纯化试剂盒。基于柱子的试剂盒可以浓缩至500倍，超滤3-5小时，浓缩物纯度相当高。基于柱子的试剂盒能处理的样本的体积要大于基于过滤的方法。基于透析的试剂盒可以浓缩至10^9 TU/mL，需12-24小时，浓缩物纯度相当高。基于过滤的试剂盒能在不到2小时的时间内高质量回收超过90%的病毒。

GeneCopoeia提供Lenti-Pac慢病毒浓缩解决方案，通过其专利配方的试剂可以不用超滤在不到3小时的时间将病毒浓度提升10-100倍。

SBI System Biosciences提供一种低速的离心方案用于浓缩逆转录病毒，Retro-Concentrin，它能在低速离心的情况下使病毒沉降。该过程至少需要12小时。它的一个优势是，所得颗粒物能在-80 °C下稳定保存。

SBI System Biosciences还提供一种Peg-it病毒沉淀方案。该方案的试剂由聚乙二醇酯配备而成，已为慢病毒颗粒沉降作了优化。当与从包装细胞收集而来的培养基混合后，它让病毒颗粒开始沉降。然后对混合物进行离心获得颗粒状物质。它能使浓度增加10-100倍。该产品已被约30篇期刊文献引用。

Cell Biolabs, Inc.提供一种慢病毒定量/滴度试剂盒。这种试剂盒能在45-60分钟内检测纯化的慢病毒或未纯化的上清液中的病毒核酸含量。病毒被珠子俘获，然后失活，读出吸光度并与标准曲线比较（试剂盒提供慢病毒的RNA标准曲线）以确定核酸的含量。

他们还提供另一种试剂盒（QuickTiter慢病毒滴度试剂盒）可以通过ELISA在抗-p24抗体包被的平板上测定病毒相关的p24基质蛋白。提供p24抗原标准曲线用以定量。

GeneCopoeia提供基于qRT-PCR的滴定试剂盒（Lenti-Pac HIV和FIV qRT-PCR慢病毒滴定试剂盒）。他们提供对照的标准曲线，RNA提取试剂和qRT-PCR试剂。使用SYBR Green技术通过qPCR定量慢病毒RNA基因组。

Cell Biolabs, Inc.提供一种专利配方的鸡尾酒试剂盒（ViraDuctin慢病毒转导试剂盒和ViraDuctin逆转录病毒转导试剂盒）能与慢病毒形成超级复合物，与聚凝胺相比，能使转导效率提升2-6倍。

SBI System Biosciences提供TransDux™，它是一种感染试剂，毒性已降至最低，与聚凝胺相比，转导效率大大增加。

他们还提供一种LentiMag试剂盒，含有纳米磁珠颗粒，用于向哺乳动物细胞转导逆转录病毒载体或慢病毒载体。通过向被转导细胞周围施加磁场，含有纳米磁珠的病毒能很快地集中到细胞上，从而增加了转导的效率。

上述公司中的很多提供即用型病毒转导颗粒，滴度高纯度也很高（Sigma，SBI System Biosciences和其他）。