详细标准膜片钳操作步骤，和来邦网对振动式切片机和膜片钳放大器的文献调查报告。
A detailed step-by-step description of the standard patch clamp protocol and Labome survey results for vibratomes and patch-clamp amplifiers.
膜片钳是一种用于研究神经元电兴奋性以及离子通道密度和功能特性的实验室电生理技术。包括电流钳和电压钳，并根据膜完整性、膜片方向及细胞内环境和电极内液的连通性不同，分为不同的构型（全细胞，单通道，穿孔膜片钳等等）。这里是一份标准的盲法膜片钳流程。
麻醉剂、实验动物、振动切片机、解剖盘、其他用于样本解剖处理所需的材料。
| 装尼龙线的U型铂金网 | 电极内插式吸管 |
| 注射器 | 显微镜及光纤光源 |
| 电脑，模拟器及软件 | 膜片钳放大器 |
| 防震台 | 微电极 |
| 微电极夹持器 | 微操纵器 |
| 记录槽 | 灌药系统 |
| 电极拉制仪 | |
125 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 1.25 mM NaH2PO4, 25 mM NaHCO3 and 25 mM 葡萄糖e, pH 7.4.
▲ 重要：渗透压应为305-315 mosm，混匀后通入95% O2–5%CO2混合气。
(全细胞膜片钳适用: 130 mM KCl, 5 mM NaCl, 0.4 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES和 11 mM EGTA, pH 7.3.).
▲ 重要：渗透压应为260-2800，2 μm滤网过滤后储存于4°C。
参考表一。
- 急性分离脑片/培养细胞/酶消化细胞室温下浸没于持续通% CO2/95% O2的ACSF/细胞外液中，记录前至少孵育2小时。
- 拉制记录电极至输入电阻为 5–8 MΩ.
▲ 关键步骤 - 设置灌流系统速度1–2 ml/min。放入脑片/细胞。
- 装灌电极内液。
- 如果需要一定的细胞形态，可选择在电极内液中加入细胞内染液，如Lucifer yellow, Cell Tracker, biocytin, Alexa biocytin, neurobiotin等。
- 将微电极放上夹持器，用10-ml注射器施加1 ml作用正压。
▲ 关键步骤 - 设置放大器至电压钳模式并应用5-10 msec 20 mV的测试脉冲。将电极缓慢接近感兴趣区域直至测试脉冲幅度可见明显的变化。
- 当微电极电阻出现明显且稳定的变化时，迅速去掉正压。
▲ 关键步骤 - 自动获得GΩ封接，或通过嘴短暂轻吸直至电阻达到至少1 GΩ。
- 一旦形成GΩ封接，运用相应的膜片钳构型方案。
- 细胞贴附型: 当达到GΩ封接时即进行实验。在此构型下，电极液应与细胞外液成分类似。
- 内面向外型: 达到GΩ封接后，缓慢将电极拉离细胞，最终一小片细胞膜将与细胞表面分离并保持GΩ封接。在此构型下电极液也应与细胞外液成分类似。
- 全细胞模型:
- 在此构型下，电极液应与细胞内液离子组分类似。
- 记录全细胞模型需将钳制电压调至与细胞静息电位相近的负电压（如星形胶质细胞-60 mV）并校正快电容。通过嘴持续轻吸直至电容和测试脉冲电流的改变显示破膜。 ▲ 关键步骤
- 如用穿孔膜片钳记录，在微电极前端灌注不含抗生素的电极液，后端灌注含抗生素的电极液。达到GΩ封接后，设置钳制电压与静息电位相近，等待阻抗缓慢降低并稳定。
- 外面向外型:达到全细胞构型后，缓慢将电极退后至阻抗剧增，显示膜片“气泡”形成。
- 分析记录。大部分数据采集软件内包含了分析软件。
来邦网 系统性地调查正式出版文章里摘录的试剂和仪器。表二列出了来自八篇出版物的振动式切片机两家主要供应商。表三列出了膜片钳放大器的主要供应商。
| 供应商 | 主要模型号 | 文章数目 | 具体文献 |
|---|---|---|---|
| Molecular Devices / Axon Instruments | AxoPatch 200B, Digidata 1322A, Digidata 1440A, MultiClamp 700B | 35 | [1-5, 11-40] |
| Heka Elektronik | EPC-10 | 5 | [41-45] |
| Dagan Corporation | 2 | [46, 47] | |
| Warner | 2 | [16, 38] |
- 确认样本活性良好且一直通氧；检查ACSF和电极内液的pH和渗透压。
- 确认电极放置于细胞密度高的区域。
- 检查电极尖端的形状；阻抗保持在正确范围（成熟细胞4-6 MΩ，小细胞8-12 MΩ）。
- 检查微电极夹持器的压力管道是否漏气。
- 清洁微电极，确认手拿时没有污染油污。
- 检查微电极夹持器的压力管道是否漏气或堵塞。
- 尝试放大器的“zap”功能。
- 换用不同电极，降低阻抗也许有帮助。
- 当形成全细胞构型，施加轻微正压。
- 检查微电极尖端形状。
- 确认样本活性良好。
- 检查溶液渗透压。
- 确认ACSF浴液和灌药系统没有气泡。
- 确认操作台或微电极夹持器没有振动。
- 确认样本活性良好。
- 熟知感兴趣细胞类型的基本电学特性。
- 电极液加入染料以显示细胞形态。
- 对代表性样本使用荧光标记物如碘化丙啶（死细胞）和Syto-11（活细胞）进行快速细胞死亡和存活分析。
是，P12前的细胞可以持久钳制，P12后的细胞越来越难钳制。
不，电极内液中的灰尘堵塞了电极尖端。如果这种情况重复了3次，重新过滤电极液。
电极尖端有气泡，拿出电极并轻敲几次。
一般来说有，45度或更小的角度更利于形成GΩ封接。
拉制尖端更大的电极（如4-6MΩ），电极下压起始在脑部更深的位置（如2/3层）。
视情况而定。如只是钳制并建立电流钳记录则可能选择5 MΩ。尖端更小（或阻抗更高）较容易形成封接但更难破膜，且通道电阻更大。尖端更大（或阻抗更低）可钳制胞体且利于电压钳，但封接较难。使用阻抗小于3MΩ的电极从未能够成功封接。
将银丝放入漂白剂15 – 30min.
在150-300 mM NaCl盐溶液，5-10V电压中电解。
有可能你的电极（记录或参比电极均有可能）未氯化完全（如银丝而不是AgCl暴露，或银氧化）。将银线放入漂白剂大约15分钟。
检查三通管/T型管。
还是视情况而定。通常0.5%-2% (w/v)一定足够。注意溶液渗透压应在290-310。