从基因型预测复杂的表型是个性化医疗的基本原则,同时,它也适用于其他领域如法医学等。但是,迄今为止,在实际应用中只有极少数案例被精确地预测,尤其是针对眼睛或头发颜色的预测时更为显著。个体年龄是决定人外观的主要因素之一。判断出不明身份人的年龄可以为警方的调查提供重要线索,这对于灾害受害者身份的确认及伪造身份案件的侦破等方面都有重要的作用。目前使用的年龄测定方法主要是依靠牙医学或骨骼学分析。使用这些技术的先决条件是人遗骸的牙齿、骨骼甚至全身完好。在分子学方法中通过无形态学信息的样品(如血迹)来预测年龄,由于这种类型的样品在犯罪现场很容易获得,因此该方法的发展具有特别重要的价值。
到目前为止,针对用DNA分析来估测人年龄的研究有两大方法。其一是基于年龄依存的线粒体DNA的缺失累积 [1] 。然而,一项旨在利用血液样品进行针对DNA的法医学研究结果指出:由于突变频率的个体差异性太大,而且突变仅仅发生在20岁以后,因此,根据线粒体DNA的缺失来判断年龄没有实际应用价值 [1] 。第二种方法是基于在年龄增长过程中端粒会逐渐变短这一现象 [1] 。常用的端粒长度的测量方法是Southern杂交,但是它需要微克量完整的DNA,这对于大多数案件来说有很大的困难。另一方面,实时PCR技术虽然可以对法医学要求的微小量DNA进行处理,但是结果显示即使是年龄相近的个体之间也有很大的差异,这使得该项技术对于法医工作来说没有实际用处 [2] 。因此,现有的这些根据DNA来预测个体年龄的方法灵敏度低、可靠性和精确度较差。
我们根据T细胞的个体突变特异性现象提出了基于DNA的年龄预测方法 [3] 。在胸腺的发育过程中,未成熟的T细胞在T细胞受体(TCR)的位点处进行DNA的重排,这种重排会导致游离的环状DNA分子的形成。大约70%的新生成熟TCRαβ+的T细胞中包含δRec-ψJα信号连接物/T细胞受体切除的环状(sjTREC)基因组DNA。之前有报道显示sjTREC的数量随着年龄的增长是呈指数线性下降的,从而反映了在人出生后不久,通过脂肪组织替代和继发性的功能缺失使得胸腺在整个人的一生中都处于退化状态 [4] 。技术上讲,sjTRECs的量化很简单:引物和水解(TaqMan)探针靶向与环状分子的接头片段互补配对。通过白蛋白单拷贝基因定量PCR检测技术实现全血样品中相对于总DNA量来说sjTRECs丰度的标准化。
TaqMan荧光定量PCR的组成包括50纳克DNA的扩增产物(该DNA是用常规方法从全血中提取得到的)、在25μl的反应混合液中含有引物各700nM,水解探针150nM以及12.5微升2×的TaqMan®通用PCR标准混合液(Applied Biosystems)。使用ABI Prism的7300机(Applied Biosystems)进行实验。PCR反应首先在50°C孵育2分钟,然后95°C下运行10分钟,接着进行如下循环:变性95°C15秒、退火/延伸60°C30秒。循环45次。在分析中用到的寡核苷酸片段的序列如下:
- sjTREC量化:
- 正向引物5' - CCATGCTGACACCTCTGGTT - 3'
- 反向引物5' - TCGTGAGAACGGTGAATGAAG - 3'
- 水解探针5' -(FAM)CACGGTGATGCATAGGCACCTGC - 3'(TAMRA)
- 白蛋白基因扩增:
- 正向引物5' - TGAACAGGCGACCATGCTT - 3'
- 反向引物5' - CTCTCCTTCTCAGAAAGTGTGCATAT - 3'
- 水解探针5' -(FAM)TGCTGAAACATTCACCTTCCATGCAGA - 3'(TAMRA)
通过两种方式可以预测年龄:1)通过分析不同年龄人的大量样品建立线性回归方程,从而推算出年龄。2)通过绝对年龄预测来估算,这种方法是基于多元对数回归和ROC曲线下面积(AUC)的精确分析来推测年龄的。在我们之前的研究中,通过对195位年龄从6周到80岁个体的分析,我们观察到四个年龄层(每个跨度为20岁)都有非常高的AUC值(从0.89到0.97,交叉实验),这和人类的世代数是相对应的。线性回归分析还显示,志愿者的年龄和sjTRECs量具有高度的相关性。(R2=0.835,p= 8.16 × 10 -215, SEE= ± 8.9岁)。迄今为止,在对人类表型特征推测方面,该方法所实现的量和预测精度都是最高的。
我们开发的sjTREC测试方法是建立在稳定的TaqMan定量PCR检测的基础之上,该方法只需少量的DNA(根据志愿者年纪从5-50纳克不等)就可以从新鲜血液样本和1.5年或更久之前的血迹标本中获得同样多的信息。即使是不同世代因年龄差别而导致的表型差异,通过一个适合于法医鉴定的DNA方法也可以准确地推测年龄。该方法可以准确地确定不明身份者的特征,为犯罪案件的侦破提供了一个新的视角。有些严重的病理状态如HIV+/AIDS或白血病等可能会极大地影响年龄推测的精确度。这些病理状态会导致外周血液中sjTREC复制数目的减少。这个问题和种族迁移对年龄推测的影响问题一样有待进一步研究。通过将当下研究中发现的一些基因标记物或表观遗传学标记物与sjTREC相结合,年龄推测的精度必将得到进一步改善。
- Karlsson, A.O., Svensson, A., Marklund, A., and Holmlund, G. (2008). Estimating human age in forensic samples by analysis of telomere repeats. Forensic Science International: Genetics Supplement Series 1, 569-571.
- Douek D, McFarland R, Keiser P, Gage E, Massey J, Haynes B, et al. Changes in thymic function with age and during the treatment of HIV infection. Nature. 1998;396:690-5 pubmed