修饰的组蛋白尾端抗体是非常必要的,它是广泛应用于染色质生物学和分子表观遗传学的研究试剂。但是他们的特异性仍是一个令人关注的问题。Albert Jeltsch团队应用包含组蛋白N-端尾部384个肽的Celluspots肽阵列,在商业抗体的特异性分析中得到不同组合的59个翻译后修饰的特征 [1] 。他们的分析显示了在大多数情况下特异性属性新颖和重要的细节包括假阴性、假阳性。并且,他们发现一些抗体基本不起作用。更好地了解抗体的特异性概况将可以使研究人员能够选择最适合实验计划的抗体,包括合适的对照和更可靠的实验结果的解释。
迄今为止,已有超过100种不同的翻译后修饰(PTMs)的组蛋白被鉴别出来,它们在染色质生物学中发挥了非常重要的作用。然而,在染色质中的组蛋白尾部PTMs的基因座专一性研究完全依赖于一个单一的方法即修饰的组蛋白尾部与抗体之间特异性的相互作用。因此,修饰的组蛋白尾部抗体是广泛应用的研究试剂,且有多家公司提供数百个该类型不同的单克隆或多克隆抗体。此外各学术团体发展出了自己的试剂。在实验研究中,抗体结合是特定的组蛋白中是否存在某些翻译后修饰的证据。由于这个解释完全依赖于抗体的特异性,因此对抗体特异性概况的详细了解是必需的。抗体可能结合第二个位点,造成了在没有主要抗原表位时产生信号(“假阳性”)。此外,在抗体结合位点的二次修饰可能导致结合的损失或减少,尽管主要的修饰还在(“假阴性”)。目前,还没有标准的、经济的、准确的、详细的方法可用于组蛋白尾部抗体的特异性分析,并且其文档资料也缺乏标准。因此,已进行的许多重要的研究都没有提供关于所使用的抗体其结合特性的详细信息。不同批次的单或多克隆抗体也有特殊的关联,这可能会使其性质有所不同。
在与Intavis AG (Cologne, Germany) 和Active Motif Europe (Rixensart, Belgium) 公司的合作中,Jeltsch的团队设计了Celluspots肽阵列,它是由组蛋白N末端尾部的8个不同区域的384个肽所组成的。它包含了许多不同组合的59个翻译后修饰。这些多肽阵列被用来研究认为是修饰的组蛋白尾部的36种不同商业抗体的相互作用特异性。在Celluspots技术中(Intavis公司专利所有),肽是在纤维素架构上和传统的SPOT合成一样被合成出来,但合成后它们溶解并滴在载玻片上。因此,Celluspots阵列制备的成本中等,并且检测只需使用少量试剂。使用二抗和ECL检测系统可以使抗体的结合可视化。阵列分析软件的开发是为了帮助分析和解释结果,这将确保抗体结合的是最优先的PTMs。该阵列在分析与修饰的组蛋白尾部特异性结合的阅读域的结合选择性时也是有用的。这种方法的一个缺点是,多肽没有进行纯化以及只检测了表面的相互作用 [2] 。因此,关键的结果可能需要用纯化多肽的溶液检测来加以确认。
在这36个商业抗体的测试中,大部分的抗体都很好的结合到他们提出的PTM上。然而,对于大多数抗体的分析显示了它们特异性方面的新发现,这对于解释实验的结果具有重要作用。一些抗体显示了在二次修饰(假阴性)存在时与多肽的相互作用会降低,另外一些则表现出与其他标志物较高的结合(假阳性)。
组蛋白肽阵列的抗体特异性分析是一种可靠的、定量化、廉价和快速的方法。它应成为抗体供应商和用户进行的一项常规质量控制程序,尤其是如果使用昂贵的下游分析应用程序如深度测序。该方法还提供了一个包括多个修饰效果非常详细的结合模式。建议在进行复杂或昂贵的实验前确定抗体的特异性。因为不同批次的特异性可能会有所不同,特别是多克隆抗体。对于交叉反应和导致假阴性的继发性PTMs的详细了解有助于研究人员在生物学研究中进行必要的对照实验。因此,特异性抗体的详细信息将有助于研究者在使用这些抗体时更可靠的解释生物学实验的结果。组蛋白尾部阵列在Active Motif公司已经商业化了,称为“MODified Histone Peptide Array”,且该公司还免费提供微阵列分析软件。
- Bock I, Dhayalan A, Kudithipudi S, Brandt O, Rathert P, Jeltsch A. Detailed specificity analysis of antibodies binding to modified histone tails with peptide arrays. Epigenetics. 2011;6:256-63 pubmed
- Zhang Y, Jurkowska R, Soeroes S, Rajavelu A, Dhayalan A, Bock I, et al. Chromatin methylation activity of Dnmt3a and Dnmt3a/3L is guided by interaction of the ADD domain with the histone H3 tail. Nucleic Acids Res. 2010;38:4246-53 pubmed
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