如何开发设计一个检测方法:5个注意事项和8个基本原理
Neil Broadway (n dot broadway at mac dot com)
Berkhamsted, Hertfordshire, United Kingdom
译者
王秀英 (mary at labome dot com)
美国新泽西州普林斯顿合原研究有限责任公司 (Synatom Research)
DOI
http://dx.doi.org/10.13070/mm.cn.2.121
日期
更新 : 2015-02-06; 原始版 : 2012-06-15
引用
实验材料和方法 2012;2:121
英文摘要

A discussion about important considerations and fundamentals for assay development.

简介

设计、构建和运行那些特定的、灵敏的和有效的检测方法在所有的生物医学研究领域都是至关重要的。例如,在基础研究应用中,可能需要在细胞水平上对一种特定蛋白进行定量,来确定在血清或者尿液中一种代谢物的水平,或者比较一种酶在正常和患病组织中的催化活性 [1] 。 制药和生物技术行业鉴定和描述潜在的新药分子 [2, 3] 。其他的研究可能需要定量测定基因表达水平 [4] 。

当发展一种生物检测时,不管是怎样特殊的用途或者是测定特别的分子,必须考虑一些基本因素。不仅对检测本身,同时对包括从样品准备到检测提供的数据质量的分析的整个工作流程都需注意。这篇文章讨论的检测发展的关键环节具有普遍的适用性。对任何类型检测开发都是有效的(例如以抗体为基础的检测方法, 如酶联免疫吸附试验和电化学分析,总蛋白/蛋白浓度的测定,酶活测定,以细胞为基础的检测或者定量PCR)。同样的,无论是基于吸光度、荧光性、放射性甚至是质谱分析的检测系统,这些关键环节都是有效的。每一种特定的检测都有它自己的特性,但是通过密切注意以下讨论的要点,研究人员可以确保开发一种有效的可靠的适合的检测方法。通常都已有用特定技术来开发某个检测方法的指导方针或具体的讨论, 例如针对肽质谱测量的讨论 [5] 。

问题要点
待测成分的确切身份?

亚型/可变剪接体

总量或修饰形式(如磷酸化/ 乙酰化/ 甲基化)?

可溶或是附着于膜上?

待测参数?待测成分的含量?

生物学功能?

成分的来源?

样品可用性

样品量

待测成分的可能含量

待测成分的稳定性

定量或半定量?半定量是否满足要求, 研究需要更为严格的定量?
待测样品数?

10s, 100s, 1000s?

样品数据转化的精简

自动化

表一. 待测成分
关键环节
与目标成分相关的注意事项

当着手开始实验方案设计时,研究者需要考虑许多问题以明确实验的确切需求。

需要检测哪些成分和参数?

开始时便需要绝对清楚要研究的成分以及将要检测该成分的何种特性。这听起来理所当然,但却是首要的问题,并且是所有后续实验活动的基础。比如,研究者是希望检测细胞裂解产物中特定蛋白的总量亦或只是磷酸化形式,还是需要两者兼顾 [6, 7] ? 研究可能需要检测特定的亚型或目标蛋白不同的剪接体 [8, 9] 。 就一种蛋白质而言,要明确待测参数是蛋白含量还是蛋白的生物学功能,如酶活性或是一种细胞因子对潜在细胞靶点的影响。或许mRNA水平检测基因表达的情况也满足要求。研究也可能需要设计不同的实验以分别检测基因表达,稳态蛋白质的水平以及生物学功能 [7, 10, 11] ; 每一种实验都会提供关于目标分子不同但互补的信息。

成分的来源

考虑待测成分的来源很重要。待测成分存在于体液如血清或尿液中?待测成分存在于实验动物的某一器官中?或是存在于病人的活组织样本中?或许来源材料是尸体的组织。当然来源也可能是体外培养的细胞,在这种情况下一个重要的事项是这些细胞是稀少的原代细胞还是数量可控的永生细胞系。

成分来源将限定样品的数量和可用性。这也会限定目标成分的浓度并严重影响到分子的稳定性,这些将在后续的章节里讨论。因此,目标成分的来源很可能对最终确定的整个检测流程产生深刻影响。

稳定性

了解待测成分的稳定性是很重要的。它相对稳定?还是非常不稳定, 因此需要在收集和制备检测所需的样本过程中进行特殊处理以获取有意义的实验数据?哪怕在分离状态中稳定的分子也可能因处于待测样品复杂的生物学环境中而变得不稳定:它们可能氧化,蛋白质水解或是翻译后修饰丢失的影响。因此有必要在样品缓冲液中加入如还原性试剂或蛋白酶和/或磷酸酶抑制剂以保证待测成分在样品处理和实验检测过程中都处在生理状态 [12] 。 此处成分来源是一个重要的注意事项;在血清中稳定的一种成分可能在肝脏匀浆液中会变得相当不稳定。如果采用活组织样本或是尸体组织进行实验,了解组织的处理和存放方式很重要,因为这会对某些成分的数量和质量有重大影响。

定量与半定量

为设计出满足要求的检测方法,很重要的一点是在开始阶段就要了解对分子进行半定量检测如蛋白印迹是否能满足课题的要求,还是需要更为严格的定量方法。

待测样品的数目

另一个重要的注意事项是有多少样品需要检测。如果只是少量样品需要检测,那耗力多步骤的人工方法是完全可以接受的。相反,如果是成千上万的样品有待检测,或许是化合物分析的一部分,那尽实验室所能以简化,流水线化并自动化整个试验流程将变得很重要。 对与待测成分相关的所有这些问题的解答非常关键,这将有助于研究者确定满足他们特定要求的最合适的方案,并且应当在考虑下一章节讨论的实验原理时牢记在心。

检测基本原理

在考虑了有关将被检测分子的这些问题之后,必须仔细注意一些不管是应用在感兴趣的特殊分子或者是被采用的特定的检测格式上的基本技术/实际问题。

检测参数关键注意事项
特异性是否只检测所需分子?
灵敏度是否能检测样品中所需分子的水平?
动态区间分子水平是否落在检测的动态区间内?
干扰检测样品中的组分是否会干扰检测?
稳定性实验能否应对检测样品/设备/操作员一些小小的改变?
重复性检测是否显现低的内部可变性?
准确性 (精密度)实验是否能精确地测定分子的绝对数量/浓度?
检测性能的分析

检测性能的统计学分析是否适当/令人满意?

检测是否具有足够的鉴别力?

表二. 检测基本原理
特异性

一个绝对关键的考虑因素是该检测法的特异性。在完全明确了需测量分子以及分子的参数之后,研究者需要建立一个将只测量他们想要测量的而没有其他的检测方法。如果这种检测法同时测量所需分子和其他分子,可能需要采取手段去提高检测的特异性。

需要考虑两个相关联的检测特异性的问题。

  • 首先,主要的检测试剂是否有相应的特定性?例如,在基于高效液相色谱检测法的情况下,一个研究员是该有多么自信才会认定一个出现在特别停留时间上的峰是他感兴趣的分子而不是另一个只是碰巧与感兴趣分子共提出来的分子。这里需要考虑分析物的来源。尿液样本的分析可能不会引起因为和感兴趣分子共洗脱而出现的峰。然而,用相同检测手段分析血清或组织匀浆样品可能未必真实了。在基于抗体的检测中,问题是,所采用的抗体是否对靶蛋白有绝对特异或者它也能与其他蛋白交互反应?有可能所得的抗体是特异于某种特定蛋白或者某种特定的翻译后修饰,例如特定位点的磷酸化作用或者基于蛋白酶而裂解产生的新抗原 [10, 11] 。 这类抗体试剂必须根据实际检测条件严格定性以确保它们有所需的特异性,只与所需的产物而不是与基质/前提分子起反应。在不使用抗体检测的实验中,例如荧光多肽裂解实验,特异性程度会降低很多。取代在特定位点裂解以产生信号,如今在多肽内任何位点裂解也会产生信号。
  • 这产生了有关检测特异性的第二个方面,即为一个在体外酶检测的具体问题。即使检测试剂在想要检测的某一特定项目中有特异性,很可能在初始细胞裂解物或者组织匀浆中,多种酶能产生相同的效果(例如磷酸化作用,蛋白水解或者其他翻译后修饰)。这个问题甚至会比上面列出的荧光肽裂解测试例子更突出。初始裂解物中的多重重复活性这一问题常常能通过列入一额外的样品处理步骤被克服,例如特定的免疫沉淀,以达到所要求的检测特异性 [12] 。 此外,根据研究的性质,最好的解决方案可能是运用使用高纯度(天然或重组)酶的活性检测。
灵敏度

检测需要有多高的灵敏度?这将取决于样品中所感兴趣分子的水平和可得的样品量。重要的一点是,检测方法必须足够灵敏,如此才能使待测组分的水平与检测方法的动态区间很好的吻合(见下文)。在决定测验版式和检测系统时,这是一项重要的考虑因素。如果相比较吸光度,要求更高的荧光性灵敏度,读数更可能要给出所需的灵敏度。通过利用酶原始信号的扩增,也能提升灵敏度 [13, 14] 。 这种“耦合”的检测系统可以非常敏感,但同时也会提升检测样品干扰试验的几率(见下文)。

动态区间

确定检测的动态区间很重要。换句话说,检测读数范围与样品中被分析的靶向分子的数量成正比。在一个测量分子浓度的实验中,如图1这个假设的例子,检测过程(无论采用什么版式)通过构建一个合适的校准曲线进行适当校准是重要的。同样地,在一个酶试验中,必须确保试验在一个区间中进行,如此才能测定最初的反应比率,使得测定比率与加入检测的酶总量成正比。 为了在检测的动态区间内,样品可能需要被稀释或者浓缩。如果待测分子在不同样品中的水平非常不同可能会是一个很特殊的问题。不能落在检测的动态区间内会导致产生假阳性数据。

如何开发设计一个检测方法:5个注意事项和8个基本原理 图 1
图 1. 检测校准/动态区间。
干扰检测读值的因素

设计检测方法时,考虑哪些可能干扰读值从而导致错误结果的因素非常重要。检测方法的特异性已在上文讨论。此处我们将讨论其它可能干扰检测读值的因素。

在荧光读值实验中,保证待测样品不会使荧光淬灭是很重要的。这可能是使用粗提的细胞裂解液或是组织匀浆进行检测时会遇到的特定问题。类似的,在用于化合物筛选或分析的荧光酶活或是细胞检测中,研究者需要尽可能的保证检测化合物不会使荧光读值淬灭。这些化合物会表现出表观抑制活性然而实际上它们对目标靶点没有直接的抑制效果。某些化合物本身便有荧光因此会导致错误的检测信号。这类化合物干扰可利用在稍长波长激发的荧光报告子加以降低 [15]. 另一个普遍的问题是样品组分的干扰如还原性试剂或去垢剂对某些常用的 蛋白检测方法的干扰。

在酶耦联的检测中(酶活或是代谢产物检测),确保耦联酶不会检测除了样品中目标成分之外的组分是非常关键的。如果这些检测手段被用于化合物筛选或分析,那重要的一点是确保这些检测方法得到合理配置因此它们只检测对目标酶的抑制而不是对耦联酶的抑制。 如果检测样品的组分可能会有明显的干扰,研究者须要对特定步骤如(免疫)沉淀或部分纯化进行仔细考量以移除这些组分 [16] 。 关键点是无论采取何种检测手段,都要对潜在的干扰源提高警惕并设法清除或最小化它们可能带来的影响。

重复性/稳定性/准确性

为获得可靠可用的数据检测方法必须稳定并可重复。检测方法应当具有稳定性,它不能受到样品制备和处理过程中变化的过度影响。同样的,不同个体进行操作时它也应当能给出相同的结果。检测方法也应当具备高重复性(也称为准确性),以保证实验内和实验之间变异程度都尽可能小。在单次的检测中,标准品和真实样品的重复检测应当给出非常接近的读值。类似的,检测读值间因操作日期带来的差异也应当很小。

如果检测方法是为了测定特定成分的绝对含量(非相对含量),它应当以公认的标准进行校准(见上文)以便给出准确的定量。

满足要求的稳定性,可重复性和准确性依赖于检测的目的,因此必须由研究者根据自己的特定目标进行调整。

检测方法效果的统计学分析

假设符合高斯分布,两组结果之间的差值如果大于2SD(标准差)就被认为在95%的置信区间上存在显著性差异。类似的两组结果之间的差值如果大于3SD(标准差)就被认为在99.7%的置信区间上存在显著性差异。 因此,检测方法的重复性(精度)越高,也就是说实验读值的SD越低,检测方法的区分度将越高。

如何开发设计一个检测方法:5个注意事项和8个基本原理 图 2
图 2. 检测方法效果评估。

检测方法的效果可通过多种不同的方式进行分析。信号背景比或是信号窗口(S/B=平均信号/平均背景)和信噪比(S/N=平均信号-平均背景/背景的SD值)常被用来分析检测方法的效果。然而,这些比值无法充分考量检测方法的变化性。一个简单的统计检验,Z’值被开发出来通过同时考量信号窗口和检测变化性以检验检测方法的质量。 Z'值越高(图2),检测方法的区分度越高,完美的检测方法的Z’值为1.通常高通量检测方法的Z’值只要>0.5便可。尽管Z'值检验源自对HTS检测方法的评估,它已成为检测方法质量评估的通用标准并可适用于各种检测方法 [17] 。

无标记检测和药物发现/化合物分析

在药物发现研究中频繁使用以自动的方式进行的高通量测定的荧光和发光标记检测方法。然而,随着新技术的发展,对使用无标记的利用生物物理检测方法有越来越多的兴趣 [18-20] 。现在市场上有许多无标记检测仪器 [18, 19] 。重要的是,无标记测定法避免报告系统所造成的假象。 例如,通常使用的生物发光性报告分子萤火虫萤光素本身是GPR35的部分激动剂 [21] , 因此潜在地复杂化了化合物/药理数据的解释。无标记检测一个额外的好处是,它们允许在疾病相关的主要针对受体的内源性表达水平的原细胞和干细胞进行化合物的筛选 [20] 。

意想不到的报道子-化合物相互作用也可能发生在生物化学测定(除了以上讨论的淬火和自发荧光的问题)。例如,好几个当用TAMRA标记的肽底物显示活化SIRT1的蛋白脱乙酰酶活性的化合物在用未标记的版本相同的肽的天然全长蛋白底物酶测定中并无活性。用TAMRA标记的底物所观察到的活化是一种假象,是由于与TAMRA荧光团的化合物的直接的物理相互作用 [22] 。

因此,在设计和验证用于筛选/化合物分析的目的时,必须考虑化合物和报道子-相互作用的可能性是非常重要的。应慎重考虑使用无标记检测在筛选时的一些的潜在利益。

参考文献
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ISSN : 2329-5147